TLS不同的空间分布

研究者纳入了19例接受新辅助免疫治疗的HCC患者治疗后的手术样本，及55例未经系统性治疗的HCC手术患者样本。首先根据CD20免疫组化结果，将直径大于150μm的CD20+淋巴细胞团定义为TLS。根据TLS的定位，分为肿瘤内TLS和肿瘤旁TLS。19例治疗后的肿瘤中有12例（63.2%）出现TLS，27例未经治疗的HCC肿瘤中出现TLS。新辅助治疗后肿瘤内TLS密度显著高于对照组，且与治疗响应显著相关。完全响应患者的肿瘤内TLS比例最多。

治疗前样本的TLS分析

为了分析TLS是否在治疗前就存在，研究者分析了13例患者治疗前样本，这些患者有足够的治疗前活检样本进行免疫组化检测。虽然没有成熟的TLS，但是研究者发现了CD20+CXCL13+淋巴细胞团存在于6例患者治疗前样本中，并且与之后的治疗响应相关。但是，通过HE染色只发现了2例患者存在TLS，因此研究提出了活检中CD20+CXCL13+淋巴细胞团而非HE染色可见的TLS也可以作为预测标志。

新型退化形态TLS的解析

研究者发现了治疗后残留肿瘤内和肿瘤消退区（regression bed）存在不同形态的TLS。在残留肿瘤内主要是经典的成熟TLS，包括CD20+ B细胞生发中心、CD21+ FDC网络、B细胞区和T细胞区。而在肿瘤消退区中存在一种非典型形态的TLS，CD20+ B细胞滤泡分散，呈环状分布，生发中心标志CD21和CD23弱表达，研究者命名为退化型TLS（involuted TLS）。这些退化型TLS存在于7例完全响应患者的肿瘤消退区。

为了解析成熟TLS和退化型TLS的微结构组成差异，研究者对9例患者进行了空间单细胞蛋白组分析，检测了38个marker，分析了38个TLS区域，包括20个成熟TLS和18个退化型TLS。与免疫组化结果一致，空间单细胞蛋白组发现了退化型TLS中CD20+ B细胞分散，分布， CD21和CD23的弱表达。但是T细胞区却持续存在，富含成熟树突细胞（DC-LAMP+CCR7+HLA-DRhi），CD4+Tph细胞（CXCR5⁻CXCR3⁺）与CD8+T细胞紧密接触，记忆T细胞标志（CD45RO+CD25+）高表达。

空间单细胞蛋白组细胞分割之后，分析了6万多个单细胞，诠释了16种细胞亚群。除了不同细胞亚群在成熟TLS和退化型TLS之间的比例差异，特别是发现了以B细胞亚群为中心的空间互作关系显著不同。在成熟TLS中，细胞邻域以高表达BCL-6的B细胞为主，而在退化型TLS中，细胞邻域以低表达BCL-6的B细胞为主。但是T细胞区的空间结构保留，呈现持续抗原呈递，包括成熟DC细、Treg、增值T细胞和效应T细胞之间的互作关系。

研究者也进行了显微切割后的免疫组库测序，发现了B细胞在退化TLS中经历了更大的抗原驱动的阳性选择，而克隆扩增的CD8+T细胞以效应记忆表型（GZMK⁺/GZMB⁺）为主可能介导长期免疫监视。

研究者也在肺癌和Merkel细胞癌免疫治疗的完全缓解患者中均发现了退化TLS，提示其可能是免疫治疗响应的共性终末结构。

该研究发现了退化TLS作为免疫记忆枢纽。肿瘤清除后，B细胞滤泡解体；T细胞区持续存在，通过DC-T细胞互作维持记忆T细胞；克隆扩增的细胞毒性T细胞（尤其组织驻留亚群）提供长期保护。通过多组学整合分析，本研究阐明了TLS是HCC免疫治疗响应的核心免疫枢纽，其空间位置、结构演变（尤其退化形态）及伴随的T细胞记忆表型，为预后预测和联合治疗策略提供了新方向。

Shu DH, Ho WJ, Kagohara LT, Girgis A, Shin SM, Danilova L et al.Immunotherapy response induces divergent tertiary lymphoid structure morphologies in hepatocellular carcinoma.Nat Immunol. 2024;25(11):2110-2123.