Visium空间转录组

分析19例胶质瘤（13例GBM，6例IDH突变型），生成70,618个spots的转录组数据。通过拷贝数变异（CNA）推断恶性区域，结合Leiden聚类和非负矩阵分解（NMF）识别基因表达程序。

PCF空间单细胞蛋白质组

使用40种抗体的panel对12例GBM样本进行空间单细胞分辨率成像，验证Visium结果并补充低丰度细胞类型信息，构建高精度的细胞互作网络。

1.细胞类型的注释

恶性细胞类型的定义上，Visium的spot代表的类型和PCF定义的单细胞类型基本相符，包括神经发育状态（NPC-like、OPC-like、AC-like）、间充质状态（MES-like、MES-Hyp）和增殖代谢（Prolif-Metab）、染色质调控（Chromatin-Reg）等状态。但是PCF定义了Visium无法识别的低丰度细胞，特别是关键的T和B细胞。Visium分辨率不足（每点含1-35细胞），难以解析稀有状态，这些免疫细胞在GBM中的含量很少，其在Visium中每个spot中的RNA丰度很低，因此Visium很难捕获，无法诠释这些低丰度细胞。但是PCF基于抗体检测，可以直接检测感兴趣的细胞类型。

2. GBM的空间组织模式

研究者实现了Visium和PCF结果的邻片对齐，利用PCF的单细胞结果验证了Visium中每个spot结果并补充了低丰度细胞的信息。通过整合Visium和PCF，揭示了GBM的三维空间组织模式。结果发现了GBM存在有序区域和无序区域，其中有序区域呈现五层组织架构，由缺氧梯度驱动。而无序区域内细胞状态混杂，缺乏缺氧信号。IDH突变型胶质瘤因缺氧缺失而多为无序区域。

研究者进行了不同像素水平的细胞互作分析，揭示了有序区域中缺氧的核心调控作用。MES-Hyp状态在缺氧核心富集，并通过分泌因子驱动周边和远端细胞状态（MES-like、MES-Ast）的分层排列和互作模式。神经发育型的恶性细胞（NPC-like, OPC-like, AC-like）与正常脑细胞互作。间充质型（MES-like, MES-Hyp, MES-Ast）与免疫细胞互作，其中MES-Ast区富集T细胞（免疫激活），MES-Hyp区富集炎性巨噬细胞（免疫抑制）。

3.GBM的五层空间模型

研究通过整合分析Visium和PCF，建立了胶质母细胞瘤的缺氧驱动五层架构模型，揭示了肿瘤组织的空间组织原则。将传统病理特征（如假栅栏坏死）与分子细胞状态的空间逻辑关联，重新定义了胶质瘤微环境认知范式。

五层空间结构：

L1（缺氧核心）：MES-Hyp主导，伴随坏死。

L2（缺氧相关）：MES-Ast和炎性巨噬细胞，介导免疫抑制。

L3（血管-免疫枢纽）：血管内皮细胞（Vasc）与增殖代谢状态（Prolif-Metab）共定位，支持血管生成。

L4（神经发育恶性状态）：OPC-like、NPC-like等浸润性状态。

L5（脑实质浸润）：正常神经元和少突胶质细胞，反映肿瘤侵袭边界。

该研究实现了Visium（高基因覆盖）与PCF（高空间分辨率）的互补。通过空间关联分析推导肿瘤组织的层级结构，揭示了缺氧的核心调控作用。突出了缺氧不仅驱动恶性表型，还组织全局空间结构，可能影响治疗抵抗。体现了分层模型的诊断价值，补充传统病理，为分子分型和预后评估提供了新维度。

Greenwald AC, Darnell NG, Hoefflin R, Simkin D, Mount CW, Gonzalez Castro LN et al. Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma. Cell. 2024;187(10):2485-2501.e26.