系统性硬化症（Systemic sclerosis，SSc）是一种进行性自身免疫性疾病（常被称为硬皮病），以免疫失调、微血管功能障碍为特征，以及广泛的皮肤纤维化。尤其弥漫性皮肤型（dcSSc）预后差，现有疗法（如IL-6抑制剂、抗CD20单抗）对纤维化逆转效果有限。虽然B细胞靶向的CAR-T疗法近来在难治性硬皮病患者中展现了非常好的效果，但是自体CAR-T细胞治疗需要个体化制备费用昂贵，异体CAR-T细胞来源受限，加之CAR-T细胞治疗可能引起诸如细胞因子释放综合征等不良事件。而CAR-NK相比CAR-T而言，既有同等的细胞清除能力但更安全。并且通过iPSC制备基因标记的CAR-NK解决了NK细胞扩增难、异体排斥问题。近日，海军军医大学上海长征医院徐沪济教授团队在《Cell》上发表了题为“An iPSC-derived CD19/BCMA CAR-NK therapy in a patient with systemic sclerosis”的论文。该研究设计并开发了iPSC来源的CD19/BCMA双靶点的CAR-NK细胞产品：QN-139b，并成功应用在一例难治性硬皮病患者中。通过临床评估、多组学分析揭示了QN-139b通过双靶点清除致病B细胞，可以重塑免疫稳态、逆转纤维化，为重症自身免疫病提供了变革性治疗方案。（华盈生物为该研究提供了皮肤组织四层结构的空间蛋白组检测）。

1.QN-139b的特性分析

研究者通过一系列基因编辑设计制备了QN-139b，以达到减轻QN-139b被宿主T细胞的识别和宿主dNK细胞的激活，以及增强QN-139b的活性和持续分化。研究者体外验证了QN-139b对CD19⁺（Raji）和BCMA⁺（MM.1S）靶细胞的高效杀伤，且双靶点共存时仍有效。QN-139b具有低的免疫原性，不会激活异体T细胞。QN-139b和异体NK共培养后，存活率仍然高达90%以上。体内安全性验证了裸鼠移植后无成瘤现象。

2.QN-139b的临床疗效

研究者应用QN-139b治疗了一例难治性硬皮病患者。该患者是一名具有20年难治性硬皮症病史的女性，抗Scl-70阳性，伴有皮肤广泛纤维化、间质性肺疾病和心肌纤维化。多种免疫抑制剂治疗（甲泼尼龙、环磷酰胺、托珠单抗等）对此患者均无效。全外显子测序发现了GPNMB（抗纤维化功能丧失）和SURF1（线粒体功能障碍）基因存在致病突变。

研究者在10天内进行了4次QN-139b灌输（D0、D3、D7、D10）。CAR-NK细胞相对淋巴细胞的比例峰值出现在第7天，在第12天又恢复至基线水平。灌输后，B细胞会快速减少，第2个月部分恢复，并持续至第6个月。Scl-70 和SSA/Ro52自身抗体在灌输后显著下降。多种免疫球蛋白也降低，促炎因子IL-6显著降低，表明了QN-139b具有抗炎效果。临床评分也得到了显著改善，皮肤厚度评分mRSS下降、EUSTAR-AI从3.68降低至第6个月的1.33、ACR-CRISS持续上升，在第3个月改善50%。皮肤超声数据显示了皮肤弹性在灌输后显著恢复，肉眼可见红斑/硬化减轻。心脏MRI显示了心肌纤维化程度显著减轻。

3.外周单细胞测序揭示QN-139b重塑患者免疫谱

为了解释QN-139b缓解临床表型的机制，研究者首先对患者外周PBMC进行了scRNA-seq及scTCR-seq、scBCR-seq。基线期、灌输后的第1、2、3个月的PBMC被收集进行分析。NK细胞在第1个月出现增加趋势，但是到了第3个月NK细胞恢复到正常水平。B细胞在第一个月被完全消除，但是在第2个月逐渐恢复。其他的T细胞、单核细胞也呈现动态的变化轨迹。尤其是针对B细胞亚群分析，研究者发现了记忆性B细胞显著减少，而初始B细胞在灌输后得到了显著增加。BCR测序揭示了增加的B细胞是新克隆产生。差异基因表达分析发现了B细胞中正向和负向调控免疫的蛋白都显著变化，说明了灌输后维持免疫平衡稳态。并且一些和自免病相关的基因在灌输后也显著下降。通路富集分析发现了炎症通路（NF-κB、Th17分化）受到抑制，而血管生成通路被激活。

4.LCM-MS空间蛋白组揭示QN-139b的组织修复机制

首先皮肤病理和多重免疫组化分析发现了灌输后胶原沉积减少，炎症浸润消失。CD19+ B细胞、CD4+、CD8+ T细胞和α-SMA⁺肌成纤维细胞被清除。之后研究者通过激光捕获显微切割联合质谱的LCM-MS空间蛋白组（由华盈生物提供服务和支持）对特定的皮肤区域进行了蛋白组学的分析。通过激光捕获显微切割分析了上皮层、基底层、汗腺层和真皮胶原层。PCA显示了灌输后第3个月和基线期存在显著的蛋白组变化。研究者鉴定了很多皮肤区域特异性变化的蛋白。通路富集分析显示了在所有皮肤层，炎症相关通路都显著下调。在基底层和汗腺层，灌输后细胞代谢相关通路被激活；在上皮层，多肽合成增加；在真皮胶原层，胞外基质组成和创面愈合通路被激活，这些说明了QN-139b灌输后的组织重塑和结构修复。

最后研究者也分析血浆蛋白组，发现了某些组织相关的信号也能在血浆蛋白组中反映出来，例如灌输后促纤维化因子的下调，以及血管生成因子的增加等。

这项研究首次证明了iPSC来源的CAR-NK在自身免疫病治疗中的安全和有效性。这种突破性疗法逆转了传统疗法无效的纤维化，实现了免疫重置。其“现货型”特性有望解决CAR-T制造瓶颈，推动细胞治疗向更安全、可及的方向发展。