2025年2月，来自中国医学科学院药物研究所的庾石山教授团队在《Acta Pharm Sin B》（IF = 14.7）发表了题为“Thermal proteome profiling (TPP) reveals NAMPT as the anti-glioma target of phenanthroindolizidine alkaloid PF403”的研究文章。研究团队利用热蛋白质组学（TPP/CETSA+MS）成功鉴定出天然产物PF403的作用靶标是烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT），二者结合降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）含量，从而发挥抗神经胶质瘤作用。

从植物黑泡娃儿藤和卵形娃儿藤中分离得到的邻菲并吲哚里西啶生物碱（CAT）具有潜在的抗肿瘤活性，而实验结果发现其活性代谢产物PF403具有更为显著的作用。但PF403在生物体内会迅速被葡萄糖醛酸化，导致其被快速清除，药效持续时间十分有限。所以基于PF403的结构，通过化学修饰设计合成了CAT3（PF403的前药），改善了PF403代谢过快的缺陷，同时展现出显著的抗肿瘤功效（图1A-C）。所以在本研究中，PF403主要应用于细胞和分子水平实验，而CAT3主要应用于动物实验。

研究首先采用ABPP技术鉴定PF403的作用靶标，然而构建炔基标记的PF403探针后发现该探针无法维持原本的药理活性，故改用非修饰策略CETSA+MS（TPP）技术筛选其靶点蛋白（图2A）。在满足筛选条件的潜在靶点中，烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）合成途径的限速酶，在多种胶质瘤细胞中异常上调，可能是PF403发挥抗肿瘤作用的靶点蛋白（图2B-C）。由此，研究者进一步验证二者间的相互作用，CETSA+WB、SPR、MST和ITC实验结果表明，PF403与NAMPT具有良好的结合亲和力（图2D-F）。此外，研究者通过共晶培养和X射线衍射，解析了NAMPT-PF403复合物的三维结构和相互作用模式（图2G）。（达吉特可提供ABPP、CETSA+MS/TPP筛靶及SPR靶点验证服务）

随后，研究者探究了PF403靶向NAMPT发挥作用的深入机制。功能性实验结果表明，PF403并未影响NAMPT的表达水平，而是显著抑制了NAMPT的酶活性，且PF403能够剂量依赖性地抑制活细胞中NAD⁺含量（图3A-B）。NAD⁺作为细胞内的核心辅酶，是维持肿瘤能量代谢、基因组稳定和生存的核心分子。肿瘤细胞由于其高代谢需求和DNA修复增强，对NAD⁺有着高度依赖性，所以NAD⁺是维持肿瘤恶性表型的代谢枢纽。而PF403通过靶向抑制NAMPT的催化活性，能够显著降低NAD⁺合成。进一步，研究者在U87胶质瘤细胞系中敲低了NAMPT，发现癌细胞的生长变得缓慢甚至停滞，且PF403原本的抗增殖活性显著降低（图3C-D）。以上实验结果表明，PF403通过靶向抑制NAMPT催化活性而发挥抗肿瘤作用。

研究者构建了U87细胞的异种移植小鼠模型，探究PF403的前药——CAT3的体内抗肿瘤活性。结果显示，与模型组相比，CAT3显著抑制了模型小鼠的肿瘤体积和重量，还显著抑制了U87细胞的增殖（图4A-B）。随后，建立了敲低U87细胞的异种移植模型，结果显示，NAMPT的缺失显著抑制了模型小鼠体内U87细胞的增殖，且CAT3原本的抑制作用显著减弱（图4C-D）。体内实验结果也再次证明NAMPT是PF403的关键功能靶标。

|   总结与讨论

由于小分子靶点往往是低丰度的调控类型的蛋白质，因此，ABPP等标记策略先对靶点蛋白进行富集后再进行质谱检测是目前小分子靶点筛选的主流技术。但本文中的小分子结构特殊，标记后活性丢失。热蛋白质组学（CETSA+MS/TPP）等非标记策略就成了优选的靶点筛选方案。CETSA+MS的方案可以在活细胞中先让药物与靶点蛋白充分结合，再裂解蛋白质、梯度加热获取差异蛋白溶液后进行质谱检测，是非标记靶点筛选策略中灵敏度和准确性都排名靠前的筛选技术。但CETSA+MS技术对于实验操作的稳定性和数据分析的要求很高，为此，达吉特建立了专门的CETSA+MS实验体系，可以为科研人员提供高质量的靶点筛选数据。

达吉特深耕于小分子靶点筛选领域多年，因为专注所以专业。针对小分子靶点研究，无论是天然化合物还是体内代谢物，达吉特均有合适的筛靶方案提供。截止目前，达吉特已经帮助中国科研工作者在种类多样的小分子靶点筛选工作中取得重要突破，相关研究成果多次出现在STTT、Mol Cancer、Circ Res、J. Hepatol、Nat Commun、PNAS、APSB等国际著名学术期刊上。筛靶就找达吉特也逐步成为业界共识。

达吉特针对中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高标准鉴定

2）空间药物分布与空间药代动力学

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）虚拟筛选、天然产物化合物库筛选