患者队列：28例HCC患者接受tremelimumab+ durvalumab联合治疗，其中14例患者同时接受局部治疗（TACE或射频消融）。依据PFS大于或小于6个月，患者分为了13例应答者和15例无应答者。肿瘤组织和血液样本在基线期和治疗过程中被收集。

多组学分析策略

肿瘤组织分析：

全外显子测序（WES）（19例患者）：评估肿瘤突变负荷（TMB）和驱动基因。

全转录组测序（bulk RNA-seq）（23例患者的36个样本）：分析基因表达通路变化。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）（17例患者的23个样本）：解析肿瘤微环境（TME）中免疫细胞亚群的功能状态。

CODEX（Phenocycler-Fusion，PCF）空间单细胞蛋白组学（16例患者的20个FFPE样本）：通过37种抗体检测分析免疫细胞的空间分布及相互作用。

CODEX(PCF)检测

外周血分析：

流式细胞术（23例患者）：1个24-plex抗体panel检测T细胞亚群、1个20-plex抗体pane检测泛免疫细胞。

细胞因子/趋化因子多重检测（20例患者）：34-plex检测评估系统性炎症反应。

动物模型验证：

使用Hep55.1c和RIL175小鼠HCC模型，验证抗PD-L1+抗CTLA4治疗的免疫应答机制。

1. 肿瘤免疫微环境特征

转录组分析发现了应答者肿瘤组织中干扰素（IFN-γ/α）通路显著激活，且抗原提呈相关基因（如HLA-DR）表达上调，提示更强的抗肿瘤免疫启动。

单细胞转录组诠释了14种主要的细胞类型，分析T细胞亚群发现了耗竭性指标LAG3 和PDCD1高表达在无应答者的CD8+ T细胞中。无应答者中的Treg细胞高表达抑制增强和促增殖的基因ITGB1(CD29)。说明了Treg对于联合免疫治疗耐受的关键作用。

转录组和scRNA-seq分析结果

免疫细胞的空间互作模式（PCF空间单细胞蛋白组）：

PCF空间单细胞蛋白组分析了30多万个细胞，诠释了6种非免疫细胞亚型和19种免疫细胞亚型。高纬度的空间分析揭示了9种细胞邻域（CN）。应答者中的免疫细胞聚集的CN中，PD1+CD8+ T 细胞和CD45RA+CD8+T 细胞显著增加。无应答者中，Tregs高表达免疫抑制分子（ICOS、PD-1），富集于免疫细胞密集区域（如CN2和CN9），并与CD8+ T细胞近距离共存。CellChat分析scRNA-seq数据验证了Treg和CD8+ T细胞间的互作频率在无应答者中显著增强。

2. 外周免疫动态

为了分析肿瘤免疫微环境的的变化能否反映到外周血中，研究者利用流式细胞术和细胞因子检测分析了外周T细胞亚群和其他免疫细胞的动态变化。结果发现了应答者外周血中经典单核细胞（CD14highCD16low）和ICOS+ CD8+T细胞显著增加，可能促进抗肿瘤免疫。非应答者外周血Treg比例显著升高，且血清IL-6水平升高，提示系统性免疫抑制微环境。这些与组织水平的结果相符。

3. 多组学整合分析

整合860个临床和组学特征，发现应答者富集炎症相关特征（如单核细胞、PD1+CD8+ T细胞），非应答者富集免疫抑制特征（如Treg相关标志物）。基于炎症/免疫抑制特征集的ROC曲线分析（AUC 0.79-0.86），显示多组学特征对治疗反应的预测潜力。

4. 动物模型验证

联合治疗（抗PD-L1+抗CTLA4）显著抑制肿瘤生长，且疗效与TME中CD8+ T细胞浸润及Treg减少相关。在治疗后疾病进展组中CD8+ T细胞和Treg间的距离显著缩短，与临床结果相一致，说明了Treg和CD8+ T的空间互作是联合免疫治疗无响应的关键因素。

本研究通过多组学整合分析，揭示了HCC免疫治疗应答与Treg空间分布及外周免疫动态的密切关联，为个体化治疗策略及联合靶向Treg的方案提供了理论依据。未来需在更大队列中验证特征集的预测价值，并探索靶向Treg的联合治疗策略。

附：本文PCF空间单细胞蛋白组检测的抗体详细信息

华盈生物空间多模态研究体系