T细胞是抗肿瘤免疫的核心执行者，其功能可能被肿瘤微环境抑制或重塑。然而，传统研究方法（如单细胞转录组）在全面解析T细胞亚群的表型、克隆性及空间分布方面存在局限。为了全面解析B-NHL 的T细胞异质性，一项发表在《Nature Cell Biology》上的研究通过整合多模态单细胞技术（CITE-seq、TCR-seq）、流式验证和CODEX高分辨率空间蛋白成像（Phenocycler-Fusion，PCF空间单细胞蛋白组），研究团队构建了高精度T细胞参考图谱，联合单细胞转录组和表面蛋白表达定义了14个功能特化的T细胞亚群，比较了DLBCL、FL、MCL、MZL及健康淋巴结中T细胞组成、克隆扩增及空间分布的差异，发现了PD1+TCF7-终末耗竭T细胞与不良预后相关，为免疫治疗分层提供了依据。

该研究总共收集了101个来自肿瘤患者和正常的淋巴结样本（LN），包括DLBCL (n = 28)，FL (n = 30)，MZL (n = 15)，MCL(n = 15)，rLN(n=13)。首先CITE-seq分析了其中51个LN样本，利用70种表面蛋白抗体，联合转录组定义了14种T细胞亚型。例如高表达MKI67的增殖型（Tpr），辅助型（Th）（包括中央记忆CM1/CM2和效应记忆EM1/EM2亚群），CXCR5+ PD1+滤泡辅助型（Tfh），FOXP3+调节型（Treg），细胞毒性（Ttox）（包括干细胞特性的PD1+TIM3-和终末耗竭的PD1+TIM3+亚群）。

分析淋巴瘤亚型特异的T细胞浸润模式，结果发现了DLBCL和MCL富集PD1+TIM3+(TCF7-) Ttox细胞，缺乏naive T细胞。FL和MZL富集Tfh和IKZF3+ Treg EM2细胞。预后关联分析揭示了PD1+TIM3+ Ttox细胞比例高与DLBCL和FL患者较差的生存相关。克隆扩增分析发现了DLBCL/FL/MZL中PD1+TIM3+ Ttox和Tfh细胞克隆扩增显著，而MCL中T细胞克隆多样性较高，类似健康淋巴结。

为了分析T细胞亚型的空间分布和互作关系，CODEX（PCF空间单细胞蛋白组）技术对来自19例患者的35个淋巴结样本进行了50种抗体的检测。总共分析了550多万个细胞，定义了8种T细胞亚型，和其他非T细胞。

空间邻域分析（Neighborhood Analysis）揭示了10种细胞邻域类型（N1-N10），反映了不同的功能区域。例如富含B细胞和FDC 的N1（B细胞滤泡）；Tfh与FDC共定位的N2（生发中心）；耗竭T细胞（PD1+TIM3+ Ttox）、巨噬细胞与肿瘤B细胞共存的N4（DLBCL特征区）；记忆T细胞、Treg和耗竭T细胞聚集的N6/N7/N9（滤泡间T细胞区）；富集基质细胞、巨噬细胞和粒细胞的N10（窦区）。

细胞邻域揭示了不同亚型的特异性微环境模式。例如DLBCL中组织结构被破坏，包括N4（耗竭T细胞区）显著扩张，N7/N8（初始/记忆T细胞区）缺失。DLBCL中B细胞主要邻近巨噬细胞和基质细胞，形成免疫抑制微环境。在FL中生发中心样结构N2（Tfh/FDC区）扩展，周围环绕N6/N9（Treg/耗竭T细胞区），支持恶性B细胞增殖。FL中B细胞与Treg和Tfh密切互作，促进免疫逃逸。在MCL中N1（B细胞区）占主导，缺乏T细胞浸润，提示物理隔离导致的免疫逃避。

CODEX（PCF空间单细胞蛋白组）揭示了B-NHL实体特异的T细胞分布模式及其与肿瘤微环境的复杂互作。这些发现为理解免疫逃逸机制和开发空间靶向疗法提供了重要依据。

CODEX（PCF空间单细胞蛋白组）检测的50种抗体列表

这项研究通过多维度解析B-NHL的T细胞景观，不仅揭示了不同实体的免疫特征和预后标志，还为开发靶向微环境的新型疗法提供了科学依据，标志着淋巴瘤免疫治疗从“一刀切”向精准分型指导的个体化治疗迈出重要一步。其技术方法和数据资源将成为领域内的重要参考，加速未来基础与临床研究的突破。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势