PhenoCycler-Fusion（PCF，原CODEX）空间单细胞蛋白组学已成为解析组织微环境的核心工具。Nature Methods也将PCF和其他空间蛋白组学评选为 2024 年度技术。PCF的核心优势是单细胞级空间分辨率（0.25μm），直接定位目标蛋白在组织中的精确坐标，尤其适合研究细胞间相互作用与空间异质性。然而，如何系统地定量分析PCF发现的空间结构与疾病表型和进展关系，以及如何深入到分子表达层面解读这些空间结构的生物学意义，目前仍然具有挑战性。近期，《Nature Genetics》上发表的一篇名为《Quantitative characterization of tissue states using multiomics and ecological spatial analysis》的文章，提出了 MESA（Multiomics and Ecological Spatial Analysis）框架，通过整合生态学原理与多组学数据，系统量化组织微环境的空间多样性，揭示细胞邻域的动态变化及其与疾病表型的关联。MESA的创新点在于将生态学中的生物多样性指标引入空间组学，结合单细胞数据（如scRNA-seq）增强空间分辨率，提供了一种全新的组织状态分析工具。

1.多组学数据整合

技术基础：利用MaxFuse算法将空间组学数据（如CODEX、CosMx）与单细胞数据（如scRNA-seq）进行跨模态匹配，生成虚拟多组学空间图谱。

关键步骤：

特征对齐：通过共享标记物（如CD3蛋白与CD3 mRNA）计算跨模态距离矩阵。

CCA降维：基于典型相关分析（CCA）提取多组学嵌入特征，优化细胞配对。

邻域特征向量（NFV）：对每个细胞的k近邻（k=20）计算平均蛋白/mRNA表达或细胞类型组成，表征局部微环境。

功能分析: 差异表达（DE）分析、基因集富集分析（GSEA）和配体-受体相互作用（LRI）分析，以增强对组织重塑的机制理解

2.生态学启发的空间分析

多尺度多样性指数（MDI）：

将组织分割为不同尺度的区块，计算每个区块的Shannon多样性指数，通过线性回归斜率评估多样性随尺度的变化。

低MDI：均匀分布；高MDI：异质分布。

全局与局部多样性指数（GDI/LDI）：

GDI：基于Moran's I评估整体空间自相关性，区分高/低多样性区域的聚集程度。

LDI：通过局部Moran's I识别热点（高多样性区域）和冷点（低多样性区域），统计细胞类型共现模式。

多样性邻近指数（DPI）：

计算热点/冷点的面积与邻近性，反映细胞互作潜力。

传统方法的局限：仅通过细胞类型组成划分生发中心为单一区域。

MESA的突破：

蛋白/mRNA表达聚类：识别出生发中心内功能分化的亚区（如增殖区E2F通路激活 vs. 抗原呈递区NF-κB激活）。

熵值提升：多组学整合后Shannon熵从2.7增至3.1，揭示更精细的微环境结构。

MESA发现了在生发中心内存在的不同邻域（标记为0、1和3），这些邻域在传统的细胞组成分析中可能无法被识别。

热图展示了不同邻域内的所有检测的46种蛋白（CODEX）和Top50 mRNA（scRNA-seq）的表达模式：尽管这些邻域在细胞组成上相似，但在蛋白质和mRNA的表达水平上存在显著差异。例如，Ki67、CD21和CD22等蛋白以及CD74和TUBAIB等mRNA在不同邻域中有不同的表达模式。这些指标可以定义生发中心不同的B细胞亚型。

细胞邻域的差异表达（DE）和基因集富集分析（GSEA）揭示了邻域在功能上的差异。例如，邻域0显示出与E2F靶点、G2M检查点和DNA修复相关的通路富集，而邻域3则显示出与TNF-α、NF-kB和IFN-γ信号相关的通路富集。这些发现与生发中心暗区和亮区的功能差异一致，反映了B细胞增殖与抗原呈递之间的区别。

通过MESA的分析，我们能够更深入地理解扁桃体组织中复杂的细胞相互作用和功能状态。这种方法不仅提高了我们对组织结构的认识，还为免疫检查和反应机制的研究提供了新的视角。

以往关于结直肠癌（CRC）的研究确定了CLR（克罗恩病样反应）和DII（弥漫性炎症浸润）两种免疫细胞空间分布分型。将MESA的生态学指标应用于CRC数据集揭示了CLR和DII亚型之间的显著差异。CLR患者显示出更高的MDI，其细胞多样性在不同尺度上变化更动态。更高的GDI也表明高低多样性区域有明显的分离，以及更高的DPI反映了更大、更近的热点。相比之下，DII患者显示出更多混合的模式和更小、分散的热点。

MESA vs. 病理学家分类：

基于多样性指标的Cox模型（C-index=0.734）优于传统CLR/DII分型（C-index=0.717）。

分析热点区域内的细胞组成和共存情况发现了热点区域的差异比整个组织更为显著。例如，B细胞在CLR中的频率高于DIl，特别是在热点区域与整个组织的比较中更为明显。DII患者特别是热点区域内的Treg细胞更为丰富。在热点区域，DII与CLR之间的Treg细胞频率差异才变得显著，在整个组织中则不显著。这些Treg细胞经常与CD68+CD163+巨噬细胞（M2样型）共同出现，这与Treg细胞与M2型巨噬细胞一起可能在肿瘤微环境中促进免疫抑制的观点一致，可能推动DII患者出现更差的结果。

整个组织（左）和热点（右）中CLR和DII的细胞共存情况，其中节点大小表示细胞类型丰度，颜色显示边缘计数（更红表示更多）。边缘粗细代表共存频率。

最后，利用MESA的多组学框架，通过MaxFuse整合CRC的scRNA-seq数据和CODEX数据，对热点与冷点中的CD68+CD163+巨噬细胞进行了差异表达分析，揭示了热点与冷点中细胞的不同功能状态。冷点中的CD68+CD163+巨噬细胞表达较高的LYVE1，说明是淋巴/血管相关的M2型巨噬细胞。热点中CD68+CD163+巨噬细胞高表达干扰素刺激基因（ISG20,ISG15）和细胞因子(CXCL10，CCL5)，提示肿瘤相关表型。

MESA能够进行全面而深入的肿瘤微环境分析，从而显著提升结直肠癌预后预测的准确性。这种的多样性指标不仅揭示了肿瘤微环境的复杂性和异质性，还为临床实践提供了有价值的信息，有助于改善患者的治疗效果和生活质量。

|   总结与讨论

MESA通过结合生态学概念和多组学整合能够系统地量化空间多样性，并识别与疾病状态相关的热点区域。研究结果表明，MESA在揭示复杂的组织结构和功能动态方面具有显著优势，为理解疾病机制和治疗机会提供了新的视角。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势