肝细胞癌（HCC）术后复发率高达70%，现有预测工具（如TNM和BCLC分期系统）在早期HCC复发预测中仍有不足，可能因未考虑肿瘤微环境（TME）的空间异质性。近日，中国科学技术大学孙成教授、刘连新教授和新加坡科学技术研究局Joe Yeong团队合作在Nature上发表了题为“Spatial immune scoring system predicts hepatocellular carcinoma recurrence”的研究论文。该研究利用空间转录组、空间蛋白组和多重免疫组化等空间技术发现了自然杀伤细胞（NK细胞）在肿瘤侵袭前沿（IF）和中心（TC）的空间分布与HCC复发相关。

利用机器学习（XGBoost）开发了基于5个生物标志物（SPON2、ZFP36L2、ZFP36、VIM、HLA-DRB1）空间蛋白表达的TIMES评分系统。TIMES在5个多中心队列（231例患者）中验证，预测准确率达82.2%，特异性85.7%，显著优于现有分期系统。研究者开发了在线TIME分析工具（https://sun.times.ustc.edu.cn/），可辅助早期HCC的治疗决策。

该研究在发现阶段利用了10x Visium空间转录组、多重免疫组化（mIHC）和GeoMX DSP空间转录组发现了NK细胞在肿瘤侵袭前沿（IF）的空间分布与HCC复发相关，鉴定了和复发相关的CD3-CD57+成熟NK细胞亚型的特征基因。利用机器学习筛选和构建了5个生物标志物空间蛋白表达的TIMES评分系统。验证阶段利用mIHC在大队列中评估了TIMES预测HCC复发的能力。功能实验揭示了表达关键标志物的NK细胞亚型的抗肿瘤机制。

17例HCC（6例复发，11例未复发）开展10x Visium空间转录组学。无监督聚类联合病理确认将组织分为了癌旁基质（AS）、肿瘤侵袭前沿（IF）和核心区（TC）。基于细胞特征基因表达分析不同区域中NK细胞、T细胞、B细胞和髓系细胞的比例，发现了IF和TC区域的NK细胞在未复发组显著富集。

Q：Visium空间转录组捕获的6.5mm x 6.5mm组织大小的数据结果能否代表全组织切片？RNA定义的细胞类型能否与蛋白一致？

研究者在61例（30例复发，31例未复发）全组织切片样本中，开展了mIHC验证。CD16、CD56、CD57以及阴性marker CD3定义的3种NK细胞亚型，都在未复发的IF区域显著富集。但是只有CD3⁻CD57⁺成熟NK细胞在IF的高浸润与更长无病生存期（DFS）具有显著相关性。

Q:发现空间特定区域富集的细胞亚型与复发相关，在这些区域中该细胞亚型高表达的基因是否和复发有关？

8例HCC样本进行GeoMx DSP空间转录组分析。在AS、IF和TC区域圈选CD57高表达的ROI，总共分析了64个ROIs。研究者进行了差异基因筛选，通过DSP发现了241个差异表达基因（DEGs），联合单细胞测序的结果筛选了其中23个在NK细胞高表达的基因，机器学习筛选了其中的5个标志物（SPON2、ZFP36L2、ZFP36、VIM、HLA-DRB1）的空间表达模式具有最佳预测性能。

Q: RNA的空间表达模式是否和蛋白表达一致？

研究者开展了LCM-MS空间蛋白组分析。2例未复发和4例复发的FFPE样本被分析。激光显微切割了总共61个ROIs。复发：6个AS ROIs；9个IF ROIs；6个TC ROIs。未复发：5个AS ROIs；21个IF ROIs；14个TC ROIs。基于蛋白表达分析的结果证实了未复发的IF和TC区域显著富集NK细胞。潜在生物标志物的表达在蛋白水平也得到了基本一致的结果。

Q: 空间组学驱动的临床标志物转化选择RNA还是蛋白？

利用61例mIHC数据进行模型构建。借助全切片成像的优势，独立计算每个tile的表达，基于XGBoost算法整合IF和TC中的5个生物标志物的空间表达数据，生成0-1分值的TIMES评分（高分=高复发风险）。

多队列验证：在231例患者中，TIMES的AUC为0.82，显著优于TNM和BCLC系统，且在血管侵犯、肿瘤大小等亚组中保持预测力。

Q:如何解释表达这些标志物的细胞亚型与复发的关系？

研究者首先借助体外和体内实验分析了SPON2如何调节NK细胞表型和功能。发现了SPON2过表达增强NK细胞向肿瘤迁移。借助scRNA-seq，揭示了SPON2+NK细胞高表达激活标志物（如IFNγ、颗粒酶B），低表达抑制受体（如TIGIT）。

其次scRNA-seq分析了SPON2+NK细胞的通讯关系，发现和CD8+T细胞之间存在显著关联。研究者对28例HCC样本开展了Phenocycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组学。证实了CD8+T细胞在空间上与SPO2+NK细胞的距离更近。体外共培养实验进一步验证了SPON2+NK细胞促进CD8+T细胞活化依赖于直接的细胞-细胞接触。

未复发中SPON2+NK细胞富集在TC区域，激活CD8+T细胞的抗肿瘤活性，而在复发的患者中SPON2+NK细胞富集在AS区域。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势