空间蛋白组技术能“看见”组织中蛋白分子的精准定位，但海量图像数据如何高效分析？QuPath——这款免费开源的病理图像分析神器，正在成为空间多组学研究的“黄金搭档”！本文从实操出发，详解如何用QuPath完成空间单细胞蛋白组图像的自动化处理、细胞分割、蛋白定量及可视化，助你轻松解开组织微环境中的神秘面纱！

一、为什么选择QuPath？

1. 免费开源+跨平台：支持Windows/Mac/Linux，无版权限制，科研友好；

2. “一站式”分析：从图像导入、细胞分割到蛋白定量统计，全流程覆盖；

3. AI算法加持：支持机器学习模型训练，适应复杂组织结构的精准识别；

4. 与空间组学技术兼容：可对接PCF空间单细胞蛋白组等多平台数据。

适用场景：肿瘤免疫微环境和器官发育空间图谱等研究。

二、软件下载安装

Qupath 软件是一款支持win mac linux系统的软件，开源免费。用户可以通过访问官网链接：https://qupath.github.io/进行下载。

除此之外，还需要安装在细胞分割过程中需要用到细胞分割模型，目前主流的细胞分割模型包括Stardist、cellpose和deepcell等等。Qupath软件通过软件插件的形式加载模型进行细胞分割。Qupath软件安装完成之后将模型插件拖入到软件中即可成功安装模型插件。

三、QuPath分析PCF空间单细胞蛋白组图像全流程

1. 分析准备

分析图像前请确保QuPath软件、分割模型插件已经正确安装，分割模型文件及用于分析的图像文件已准备完全。

如下所示为打开后的QuPath软件界面，通过菜单栏Extensions可以查看分割模型是否安装完成。完成上述准备工作后即可进入后续分析流程。下图展示的是QuPath中安装了Stardist插件。

2. 新建和打开对象

通过Creat Project 进行新建对象保存目录，将分析文件结果保存到空白文件夹中，如需要打开之前新建的对象可以通过Open project。

点击Add Images，根据下方图中顺序添加需要进行分析的PCF空间单细胞的原始.qptiff图像文件，或者直接将需要分析的图像文件拖入qupath软件中。（注：需要先新建Project才能拖图像，没有creat project直接拖图像到软件中也能查看图像但无法编辑和后续操作。）

打开的图像数据如下所示，我们可以通过滚轮放大缩小等对数据进行编辑操作。其中红色圈出的部分为各种注释工具，可用于后续对感兴趣的ROI进行圈选，可选择不同的圈选形状和方式。

通过点击①按钮可以弹出本项目的marker通道信息。点击marker前面的②颜色色块可以调整对应marker的颜色展示。通过③可以选择是否在右侧展示对应marker的表达分布信息。通过④可以调整选择的marker通道的对比度亮度等。

3. 细胞核识别与细胞分割

通过前面对各通道marker的表达情况进行大致了解后，我们通过Stardist模型对感兴趣的ROI进行细胞分割以获取ROI中的荧光表达强度信息。

对感兴趣的ROI的圈选后，将Stardist模型的.groovy格式的文件拖入到QuPath当中，此时会弹出来一个弹窗，点击OK后到.groovy文件对应文件夹中将另一个分割训练模型文件选中打开后图像就会进行细胞分割操作。图像分割的时间由圈选的ROI区域中细胞数量决定，细胞数量越多分割时间越长，图像分割完成后我们可以在圈选好的ROI中看到各个细胞的分割情况。

4. 导出分割图像结果

细胞分割完成之后，我们可以导出每个蛋白靶标在各细胞的荧光表达强度矩阵，用于后续的数据分析。点击Measure然后点击Export measurements弹出选项框，将①需要导出的图像文件由Available移动到Selected中，在②处设置导出的文件路径及文件名称，③选择为Cells， ④选择保存为Comma间隔的.csv格式，待数据渲染结束后通过点击⑤左侧选项框会弹出需要导出的数据列信息，可以通过勾选需要导出的列前的方框选择需要导出的数据，常规情况下我们会选择导出ROI、xy坐标和各蛋白marker表达的荧光强度。

四、常见问题与解决方案

1.  Q:之前在其他电脑上已经完成新建Project或者其他图像编辑工作，现在课题组其他老师也需要对图像进行处理，将图像和project文件拷贝到其电脑上无法打开图像。

     A:PCF下机的.qptiff文件较大，为保证图像的清晰度和节约空间，project中只存在缩略图，更换电脑后.qptiff的文件路径发生改变而无法打开，可通过更改Image图像路径来解决。 

2.  Q:我在图像中圈选了多个ROI区域，但是导出的结果当中无法进行区域的区分。

     A:在圈选ROI时候 ROI默认命名为Annoation，可以通过右键设置class重命名来区分不同的ROI.

3.  Q：我按照流程操作进行细胞分割，但是在最后导出数据的时候发现没有marker表达列的信息。

     A:在整个图像处理过程当中请注意及时保存，如果在图像分割完成后没有进行保存操作那么导出数据时会出现没有marker荧光强度的信息。

五、结语

QuPath以其零成本、高灵活性和强大的社区支持，正在成为空间单细胞蛋白组分析的“平民化工具”。无论是探索疾病机制，还是开发临床诊断模型，掌握这一技能都能为你的研究按下“加速键”！

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