肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第三大癌症死因，其复杂的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）异质性是治疗耐药和预后差异的核心原因。近年来，单细胞技术的迅猛发展极大地深化了我们对肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）异质性的认知。然而，传统的单细胞测序（scRNA-seq）和空间转录组技术在解析细胞异质性时，存在分辨率较低、缺乏蛋白信息等局限性，难以有效捕捉细胞间的直接相互作用以及精细的空间特征。

2024年9月，王红阳院士/陈磊团队在Nature Cancer（IF=23.5）发表了题为“Spatial single-cell protein landscape reveals vimentinhigh macrophages as immune-suppressive in the microenvironment of hepatocellular carcinoma”重磅研究，通过PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组技术绘制了高分辨率肝细胞癌单细胞图谱，揭示了VIM+巨噬细胞在肝细胞癌免疫抑制中的关键作用，为个性化治疗提供了新靶点。

01  利用PCF空间单细胞蛋白组构建HCC肿瘤微环境图谱

研究团队采用PCF空间单细胞蛋白组技术，对401例肝癌患者组织样本进行了36种抗体的同步检测（涵盖免疫、基质、肿瘤标志物），总共生成了300多万个单细胞的空间蛋白表达矩阵，定义了9种细胞类型和67种细胞表型。

研究者进行了基于细胞类型或者表型的细胞邻域（CN）分析以及配对细胞互作分析（PCI）。分析细胞类型或表型、细胞邻域和细胞互作等变量和预后的相关性，发现了VIM+巨噬细胞与患者的复发风险高度相关，而肿瘤细胞和CD8+T细胞的邻近互作与复发呈现显著负相关，说明T细胞浸润对于预后的关键作用。

02  发现与预后显著相关的空间特征

首先研究者基于所有的CN进行无监督聚类，定义了14种肿瘤模式（Tumor Pattern，TP）。其中TP-p53模式与预后不良显著相关，这类患者的5年复发风险非常高，生存率显著低于其他模式患者。由于TP分类中，采用的很多细胞邻域不具有普遍性，只在部分特定样本中出现，因此无法作为普遍适用的预后分层工具。研究者选择了15种广泛存在的细胞邻域进行聚类，识别出5种具有代表性的空间分布模式，分别是：SP-HI（高水平免疫和基质浸润模式）、SP-LI（低水平免疫和基质浸润模式）、SP-Endo（高水平内皮细胞模式）、SP-TIM（高肿瘤细胞与免疫细胞混合模式）和SP-PF（高增殖细胞富集模式）。进一步结合患者的预后数据进行分析，发现这五种空间模式能够显著区分患者的复发风险和总生存率。具体而言，SP-PF和SP-HI模式与癌症复发风险的增加密切相关，而SP-LI模式则与较低的复发风险相关。

03  VIM+巨噬细胞与Treg细胞互作对癌症进展的重要作用

研究者分析SP与预后相关的特征，发现了与复发高风险相关的SP-HI中VIM+巨噬细胞危害比(HR)评分较高，与前面的分析结果一致，说明了VIM+巨噬细胞在HCC进展中的重要作用。细胞互作分析揭示了VIM+巨噬细胞和Treg之间的互作与预后不良最具显著相关性。并且相比早期患者，在晚期HCC患者中VIM+巨噬细胞和Treg之间的空间距离更近。空间分布上VIM+巨噬细胞主要聚集在肿瘤核心区域，并与Treg细胞形成共定位单元，而CD8+T细胞则被排挤到周边区域。这一结果提示VIM+巨噬细胞可能具有免疫抑制特性。

04  VIM+巨噬细胞通过分泌IL-1β激活Treg细胞的免疫抑制功能

研究者随后开展了单细胞测序和空间转录组分析，揭示了VIM+巨噬细胞的基因表达特征，发现了VIM+巨噬细胞和Treg之间基因表达的高度关联性，提示了VIM+巨噬细胞可能作用于Treg，从而增强免疫抑制。 配受体分析进一步揭示了VIM+巨噬细胞或许通过白介素-1β（IL-1β）和干扰素-γ（IFN-γ）参与对Treg细胞的调控。随后，研究者利用流式细胞仪分离了VIM+和VIM低表达的巨噬细胞，并检测了其中IL-1β的表达水平。结果表明，在不同类型的巨噬细胞中，VIM+的巨噬细胞显著高表达IL-1β，细胞共培养实验发现了VIM+巨噬细胞促进Treg分泌IL-10，而加入IL-1β抗体可显著缓解作用效果。

总结与讨论

本研究通过PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组技术，突破了传统单细胞测序的局限性，在蛋白层面解析了肿瘤微环境的空间异质性，为精准捕捉细胞互作与功能调控提供了全新思路。首次阐明VIM+巨噬细胞通过IL-1β-Treg轴介导免疫抑制的分子通路，为肝细胞癌的免疫治疗提供了潜在靶点（如靶向VIM+巨噬细胞或阻断IL-1β信号）。SP分型与VIM+巨噬细胞丰度可作为预后分层的重要标志，指导个性化治疗策略；同时，空间分布特征的解析为联合免疫疗法（如增强T细胞浸润、抑制巨噬细胞-Treg互作）提供了理论依据。该成果不仅为肝细胞癌的精准诊疗开辟了新方向，更推动了空间组学技术在肿瘤研究中的广泛应用，标志着肿瘤免疫微环境研究从“细胞组成”向“空间功能网络”的范式转变。