在探索生物系统复杂性的研究中，空间蛋白组学在揭示复杂组织的组织方式方面发挥着关键作用，近期，Nature Methods将空间蛋白组学评选为 2024 年度技术。空间蛋白组学涵盖多种技术，主要目的是基于不同的检测和分析方式来揭示组织中蛋白靶标的定位、细胞类型的组成和空间组织信息等。其中常用的一类空间蛋白组学是基于免疫组化/荧光原理的技术，包括CycIF、PhenoCycler-Fusion（CODEX升级版）、IBEX、MIBI和IMC。这些方法可以在同一张组织切片上实现超多重蛋白的检测，生成高分辨率的空间图像，揭示复杂的细胞组成及空间位置信息。

尤其是在肿瘤研究中，这些多重成像可通过检测大量蛋白靶标来识别肿瘤中的细胞表型，包括细胞类型、亚型和功能状态。例如，在多种癌症中对免疫细胞景观进行成像，发现免疫细胞组成与肿瘤特征的相关性。肿瘤细胞与周围细胞和基质相互作用，通过这些多重蛋白成像可评估细胞-细胞之间相互作用可能性，包括同型和异型细胞间的相互作用。例如，在乳腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤中，发现肿瘤细胞间多为同型相互作用，而异型相互作用如肿瘤细胞与免疫细胞间的相互作用对肿瘤功能有重要影响。肿瘤具有多种空间模式，从细胞局部聚集到空间大的区域结构，这些模式可以影响细胞间通讯。例如，通过不同的空间分析方法，确定细胞类型的分布、细胞互作的空间分布、定义局部富集模式等，发现空间模式与肿瘤预后、免疫细胞分布等的相关性（图1）。

图1 多重蛋白成像的空间分析策略

| 接下来带你快速了解不同的空间蛋白组技术原理（图2）：

基于质谱的检测方法：如成像质谱流式细胞术（IMC）和多重离子束成像（MIBI），可同时检测40-50 种蛋白靶标。二者依靠质谱检测与抗体偶联的金属同位素，MIBI通过离子束电离，IMC则是激光耦合电离等离子体源来实现电离。因检测外源性偶联到抗体上的非生物金属同位素，因此可避免荧光和显色技术的背景信号问题。但是两者相对较低的扫描速度意味着相较于基于荧光检测的方法，它们通常用于对更小组织区域的成像。

基于荧光检测的方法：包括多光谱成像和迭代荧光方法。多光谱成像采用计算方法来分离重叠的荧光团发射光谱，已实现多达20种蛋白的成像。例如PhenoImager HT（之前名为 Vectra Polaris）以及较新的Orion都是市面上可买到的多光谱仪器。迭代荧光方法可实现对40–50 个蛋白靶标的荧光成像。其操作是每一轮染色和成像后，进行抗体剥离或荧光团灭活，然后再进行下一轮染色和成像。例如， MxIF采用化学猝灭实现荧光团灭活，IBEX和MELC通过漂白实现荧光团灭活，而在 t–CyCIF中两种灭活方式结合使用。但是这些迭代荧光方法存在不足，实现高通量检测所需的时间很长，其信号去除过程可能改变组织结构和抗原表位等问题。

基于寡核苷酸标记抗体的检测方法：如由原来的CODEX技术升级为现在的PhenoCycler-Fusion（PCF）技术，该方法需要将抗体与DNA条形码进行偶联，偶联抗体一次性添加到组织切片上，利用互补探针杂交和剥离方法实现循环成像。由于是抗体一次性添加，所以不存在上述迭代荧光方法中反复剥离和洗脱导致的抗原表位破坏影响抗体结合的问题。目前已发表的应用PCF技术的检测通量最大可实现多达101种蛋白的同步成像。Akoya Biosciences 公司目前也推出了60种已验证过的偶联抗体组成的检测panel，基本可满足广泛的对肿瘤微环境生物学的研究。除了已经验证过的抗体，该技术可以方便的实现抗体偶联的自主定制化。相比MIBI和IMC，PCF更适用于大片成像，或许更能全面的分析复杂的组织空间关系。

图2 空间蛋白组技术

| 空间蛋白组图像和数据分析

空间多重成像技术通过揭示细胞多样性和相互作用改变了组织生物学的研究模式，但对其海量数据集的分析仍存在瓶颈。当前的分析流程可以概括为图像采集后处理，包括图像配准和校正（如通道串扰、背景、噪声等）；细胞分割：借助不同算法，基于大量整理的训练数据集；细胞特征量化与分类：量化蛋白质平均强度生成单细胞数据表，再通过多种方法分类，包括基于谱系蛋白标志物的过滤、门控、无监督聚类、监督机器学习建模；细胞表型分析：识别细胞类型相关功能蛋白并进一步分类（如耗竭 T 细胞）；空间分析：探索细胞间相互作用、定义微环境、分割微解剖结构并进行患者分层以获取临床见解（图3）。

图3 空间图像和数据分析

当前的分析流程也存在很多挑战。图像二维性使分割算法在重叠或密集区域易出现细胞误分类或遗漏。虽然新的细胞注释方法不断涌现，但尚无方法能够整合空间数据和已有知识框架下同时解决重叠细胞的挑战。另外分割的深度学习模型依赖大量高质量训练数据集，而目前缺乏多样化的可靠的真实数据，基于聚类的标签不理想也会影响预测准确性。当前流程碎片化，错误易在步骤间累积，缺乏数据存储、分析工作流程和可视化软件的集成，导致研究者需在不同软件和分析脚本间切换，不便于整合不同数据集信息。

虽然空间图像分析面临挑战，但借助AI系统集成分析与可视化、构建无缝集成从图像低阶处理到空间分析各阶段的模型、适应多样数据集的智能算法及足够计算基础设施将助力突破，未来有望在空间生物学等领域取得新发现。

重点推荐：PCF空间单细胞蛋白组

相比其他空间蛋白组技术，PCF空间单细胞蛋白组学展现了多方面的优势：（1）单细胞分辨率，可精确到250nm/piexl；（2）全片扫描，最大成像面积18mm X 35mm；（3）抗体一次性杂交，减少反复洗脱带来的实验误差；（4）样本兼容性高，新鲜冷冻切片和石蜡包埋组织切片均适用 ；（5）使用灵活, 既有商品化抗体Panel，也可定制化检测；（6）检测速度快，1分钟成像100多万个细胞。PCF空间单细胞蛋白组学技术应用场景非常广泛，目前已经应用在肿瘤微环境研究、组织炎症研究、以及胃肠道、神经、肾脏等其他组织结构的研究中。借助PCF技术强大的组织空间数据分析和挖掘能力，很多研究成果发表在Cell、Nature、Science等国际顶级期刊上。

HuBMAP应用PCF构建人类组织细胞图谱

HTAN应用PCF构建肿瘤空间图谱

目前空间蛋白组学研究已深入分析生物学机制，可分析大量患者队列，揭示了细胞群体和多细胞空间关系可作为药物靶点和生物标志物。空间蛋白组学将变革生命科学、生物医学发现和转化研究，推动精准医学发展。对大量含临床数据的人体组织样本进行空间蛋白组学分析可研究细胞如何组装成多细胞结构及细胞间的通信和功能互作关系，也可揭示高阶组织结构对单个细胞调控机制的影响，结合靶向实验将揭示生物学和医学问题背后的细胞功能模块。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势

|   相关文献