目前临床上需要制定策略来更好地识别哪些患者可以从单独的免疫疗法中受益，或者哪些患者可能需要化疗或放疗等额外疗法来克服耐药性。尽管一些联合放射治疗（RT）和免疫检查点抑制（ICI）的临床研究取得了成功，但许多研究结果好坏参半，部分原因是我们对RT如何影响免疫反应的机制了解有限。近期《Cancer cell》杂志发表了一项题名“Single-cell and spatial profiling identify three response trajectories to pembrolizumab and radiation therapy in triple negative breast cancer”的研究。该研究对anti-PD-1治疗并额外接受RT治疗的三阴性乳腺癌（TNBC）患者进行了纵向活检，使用PCF空间单细胞蛋白组（CODEX升级版）技术和scRNA-seq技术，对患者在免疫治疗和放疗过程中的肿瘤样本进行分析，揭示了肿瘤免疫微环境的变化，确定了三种不同的响应轨迹。

总共50名TNBC患者纳入临床试验中，分别在anti-PD-1治疗第1个周期之前、第1个周期后的第3周以及anti-PD-1治疗第2个周期和局部放疗后第3周，总共3个时间点进行活检（图1）。总共34名患者的活检样本部分用于scRNA-seq，部分用于PCF空间单细胞蛋白组检测。最终该研究分析了34名患者scRNA-seq检测的50多万个细胞表达谱，以及27名患者PCF空间单细胞蛋白组检测的5百多万个细胞的空间信息。

1.空间分析识别TNBC中的细胞群落

通过PCF空间单细胞蛋白组对活检样本的分析，确定了12个空间区域（district），包含不同比例的上皮细胞、基质细胞、免疫细胞等。d0、d1、d5 和 d11区包含89%的上皮细胞。d2 和 d10主要包含基质细胞，d7是内皮细胞区。d9区主要是髓细胞 (78%) 和一些 CD4+ T细胞 (11%)。d6主要包含了CD20+ B细胞 (10%)、CD4+ T细胞(13%)、CD8+ T 细胞 (18%)、髓细胞 (19%) 和基质细胞 (37%)。大多数CD138+ 浆细胞 (95%) 位于d8区，与上皮细胞、髓细胞和基质细胞 (>10%) 共定位。d3和d4 区以淋巴细胞为主，其中d3含有最多的 CD4+ T 细胞(39%) 和 CD8+T 细胞(41%)，而d4 含有最多的B细胞 (54%)。

图2 细胞邻域分析揭示细胞群落

2.治疗诱导响应性TNBC免疫微环境重塑

治疗前，总免疫细胞比例在响应组和非响应组间无显著差异，但响应组免疫细胞密度更高。

治疗后，响应组总免疫细胞比例增加，部分上皮细胞损失和CD8+ T细胞及浆细胞密度增加。

B细胞主导的d4区是基线时响应者中唯一比例和密度较高的区域，同时时富含T细胞的d6 密度也更高。免疫区d3、d6、d8 和 d9仅在应答者联合治疗（RTPD1）后的样本中比例增加，其中d3和d6 的比例和密度都高于无应答者。相反，RTPD1 后响应者中的上皮区 d0、d1 和 d11消失，而无应答者中没有变化。AUROC分析发现了类似的趋势，治疗前，d4 是唯一与应答相关的区域 (AUROC > 0.75)，但在 RTPD1 后，所有免疫丰富区域（d3、d4、d6、d8 和 d9）在应答者中的比例和密度均较高。这些结果说明了治疗重塑了TNBC的免疫微环境（图3）。

图3 细胞群落和治疗反应的关系

3.识别具有不同免疫轨迹的两组响应者

无监督聚类分析空间区域可以将患者分为3 组，其中大多数无应答者形成一个亚组NR，而响应患者形成两个亚组: R1和 R2。应答组表现出不同的免疫轨迹，其中 R1 开始时免疫细胞密度较高，但每次治疗后免疫细胞密度有所下降，而R2 仅在 RTPD1 后看到免疫细胞密度增加。空间关系上，在基线期和单独免疫治疗后，R1中T 细胞区域d3/d6附近具有更多的B细胞区域d4，但这种差异在 RTPD1 后消失。同样的，在基线期， R1 中T细胞邻近 d9 髓细胞区域，但这种差异也在 RTPD1 后也消失（图4）。

4.整合PCF空间单细胞蛋白组和scRNA-seq结果

研究者分析了配对的CD45+ 细胞的scRNA-seq 数据。scRNA-seq鉴定了B细胞/浆细胞、T 细胞、髓细胞和肥大细胞。并且通过差异基因表达分析 (DGEA) 和 CellTypist对 B细胞/浆细胞、T 细胞和髓细胞进行了亚群分析。相关性分析发现了PCF空间区域和 scRNA-seq 细胞亚群之间存在一致性。d4主要由 B 细胞组成，其丰度与 scRNA-seq 数据集中 B细胞的丰度相关性最强。同样，scRNA-seq 中T细胞丰度与 T 细胞富集区 d3、d6 和 d9 相关。在细胞亚群水平上，scRNA-seq 中的CD20+ sc-b0、sc-b2 亚群与 d4 的关联性最高。效应 T 细胞亚群 sc-t4 和 sc-t6 与 T 细胞区 d3、d6、d8 和 d9 表现出更强的相关性。值得注意的是， d8和 d9 与效应T细胞相关，也与抗原呈递巨噬细胞亚群 (sc-m11) 相关。研究者后续着重分析了效应T细胞扩增在空间上与抗原呈递巨噬细胞的富集具有显著相关性。对比分析发现了只有在R2响应组中，空间上d6/d9 共密度和 sc-t6 效应T细胞扩增具有显著相关性（图5）。

图5 PCF和scRNA-seq联合分析

|   总结与讨论

确定三种响应类型：研究确定了两种响应者（R1 和 R2）和一种非响应者（NR）。R1 在基线时具有高免疫浸润，对 anti-PD-1治疗 响应强烈；R2 在基线时与 NR 相似，但在联合治疗后出现免疫响应；NR 在治疗前后均无免疫响应。

揭示免疫微环境变化与响应轨迹：治疗过程中，不同响应组的肿瘤免疫微环境发生不同变化，包括免疫细胞组成、密度、空间分布以及与其他细胞的相互作用等方面。这些变化与响应轨迹相关，为理解 TNBC 免疫治疗机制提供了依据。

放疗在TNBC 治疗中的潜在作用：虽然单臂临床试验无法明确放疗对免疫变化的贡献，但多项证据表明放疗可能增强了 R2 的免疫响应，为未来 TNBC 治疗中放疗与免疫治疗联合应用提供了方向。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势