从60例转移性乳腺癌患者中获取了67例肿瘤活检样本，涵盖不同临床病理特征和解剖部位，包括激素受体（HR）和人表皮生长因子受体 2（HER2）的不同亚型及常见转移部位肿瘤。对部分样本进行scRNA-seq或snRNA-seq，并对15例样本的连续切片进行四种空间Slide-seq、MERFISH、ExSeq 和 PCF（CODEX升级版）以及H&E染色（图1）。通过创建综合数据集，整合不同方法产生的数据，分析细胞组成、基因表达模式、免疫表型和共定位等关键特征。

图1 实验设计

1.单细胞和空间表达谱分析

细胞类型注释：scRNA-seq 和 snRNA-seq 鉴定出多种细胞类型，部分细胞类型仅在特定测序方法中检测到，如脂肪细胞、神经元等仅在snRNA-seq中检测到，中性粒细胞、肥大细胞等仅在scRNA-seq中检测到（图2）。

临床特征与细胞类型组成的关联：分析不同临床特征对细胞类型组成的影响，发现患者个体差异、检测方法和取样部位等因素对细胞类型组成的变异性影响较大，巨噬细胞的频率受患者近期治疗方法的影响，免疫治疗与较高的巨噬细胞频率相关（图2）。

图2 单细胞测序分析

空间表达分析方法比较：不同空间表达分析方法在成像面积、分辨率和检测灵敏度等方面存在差异，MERFISH和PCF可覆盖整个活检样本，Slide-seq可检测较大的区域，而ExSeq 检测区域较小。不同方法检测到的细胞类型组成具有较高一致性，但ExSeq与其他方法的相关性较弱（图3）。

图3 不同空间分析方法比较

2.肿瘤相关巨噬细胞的空间分析

巨噬细胞的分布和组织方式：巨噬细胞在样本中普遍存在，其空间组织方式在不同样本和检测方法中有所不同，可分为短距离聚集、长距离聚集和混合三种表型（图4）。

巨噬细胞的亚群分析：通过整合分析鉴定出两个主要的巨噬细胞亚群，分别表达 CD163/CD68/APOE/HIF1A 和 MKI67，且不同亚群的基因表达谱存在显著差异。

图4 巨噬细胞空间互作分析

3.肿瘤细胞的空间相互作用分析

上皮-间质转化（EMT）的空间异质性：恶性细胞中EMT信号在患者内和患者间存在异质性，可以将样本分为EMT-high、EMT-low和 EMT-patched三种空间表型，不同表型与细胞周期基因和预后相关基因的表达有关。

图5 EMT的空间异质性

恶性细胞与免疫细胞的相互作用：分析恶性细胞与 T/NK 细胞的空间关系，发现恶性细胞与T/NK 细胞共定位与其MHC基因的表达有关，而SOX4表达与恶性细胞和 T/NK 细胞的空间避让关系有关（图6）。

图6 肿瘤细胞和T/NK细胞的空间互作

|   总结与讨论

该研究通过多模态分析深入了解了转移性乳腺癌的生物学特性，为临床治疗提供了多方面的潜在影响，包括指导个性化治疗、优化治疗策略、发现潜在治疗靶点等，有望改善转移性乳腺癌患者的治疗效果和预后。尤其是该研究体现了空间分析方法在转移性乳腺癌治疗研究中的多方面优势，如提供空间信息、识别细胞相互作用、发现生物标志物、评估肿瘤微环境、指导精准治疗、监测治疗反应和助力药物研发等，这些优势有助于深入理解疾病机制、优化治疗策略和改善患者预后。

附：技术比较

| PCF空间单细胞蛋白组优势

CNS正刊中的PCF实测图片赏析