作者收集了两种CDC外泌体进行后续的研究，分别是永生化人CDC外泌体（IMEX）和原代CDC的外泌体（CDC-EVs）（图1A）。经过RNA测序，发现与CDC-EVs相比，在IMEX中有多个miRNA发生显著差异富集，其中以piRNA-33044最为明显（图1B）。接下来对其进行BLAST分析，发现piRNA-33044与人Y RNA4及其假基因的3’区域有着显著重叠（同源性92%，图1C）。由于外泌体中先前有确定两种Y RNA4的衍生物，该Y RNA被作者命名为yRex3。作者接下来通过qPCR验证，证实了yREX3在IMEX中的高表达（图1D、E），并通过RNA酶A/蛋白酶K保护实验来验证yREX3在外泌体中，被外泌体膜所保护（图1F）。

图1 永生化CDC外泌体携带特殊Y RNA

图 2 yREX3能够减少栓塞并影响巨噬细胞基因表达，增强其迁移与增殖 

为了探索yREX3影响巨噬细胞基因表达的机制，作者对yREX3进行了亚细胞定位，发现其在转染后24h定位于细胞核，且显著增加了DNA甲基化程度，并且DNMT抑制剂可以消除yREX3介导的高甲基化水平（图3A、B）。通过引物特异性甲基化分析，确定了Pick1基因座5’UTR和Intron1中CpG岛的甲基化增加，且发生了Pick1显著的转录抑制（图3C、D）。前人研究表明，Pick1通过调节Smad信号传导来激活巨噬细胞极化。作者通过TGF-β磷酸化抗体芯片进行特定通路磷酸化分析，发现yREX3使得Pick1沉默而导致Smad3过度磷酸化，这是Smad3信号传导增强的标志，且使用Pick1过表达也验证了Smad3会随之发生磷酸化水平下降（图3E、F）。众所周知，Smad3是TGF-β通路的一部分，但mRNA与蛋白定量数据显示，巨噬细胞暴露于yREX3条件下并未使得蛋白分泌发生变化，表明yREX3介导的Smad3激活与TGF-β分泌无关（图3G、H）。

图 3 yREX3通过甲基化巨噬细胞DNA沉默Pick1，并增强Smad3信号传导

当前研究中，人们对Y RNA的信号转导知之甚少。作者对yREX3进行RIP实验，发现多聚嘧啶束结合蛋白3（PTBP3）的含量最高，且对PTBP3的IP产物进行qPCR也验证了yREX3的含量最为丰富（图4A、B）。PTBP3与配体RAVER1结合参与RNA转录后加工，PTBP3的敲低导致了yREX3介导的Pick1抑制丧失，这表明PTBP3在yREX3功能中起着关键上游作用（图4C），且暴露于yREX3的巨噬细胞中进行PTBP3的IP同样使得RAVER1富集（图4D），因此可以认为yREX3与PTBP3/RAVER1结合并抑制Pick1。接下来作者测试了yREX3处理的巨噬细胞能否复现yREX3介导的心脏保护作用。作者将暴露于yREX3的巨噬细胞、暴露于空载体的巨噬细胞和暴露于乱序yREX3的巨噬细胞分别注入心肌梗死后的大鼠体内，发现在48h后，接受yREX3暴露的巨噬细胞治疗或接受siPick1处理的巨噬细胞治疗的大鼠梗塞面积和肌钙蛋白水平明显降低（图4E、F），可以模拟心脏保护作用。因此，巨噬细胞中的Pick1抑制是yREX3介导的心脏保护的重要介导。

图 4 yREX3与PTBP3/RAVER1结合以沉默Pick1，进而发挥心脏保护作用

在本研究中，作者发现了yREX3，一种在永生化CDC外泌体中大量存在的非编码Y RNA，并发现其对心肌梗死大鼠具有显著的心脏保护作用。从机理上讲，yREX3与PTBP3/RAVER1结合，通过DNMT介导DNA甲基化，使得Pick1基因高甲基化而沉默，而Pick 1基因编码巨噬细胞中的一种关键衔接蛋白。因此，yREX3是一类新的心脏保护性ncRNA药物的先导化合物，为心脏保护性非编码RNA药物的开发提供新的见解和思路。

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