探究骨骼肌如何控制骨形成对于理解肌肉和骨骼之间的相互作用以及开发退行性骨病的治疗方法至关重要。2023年11月7日，四川大学廖立及田卫东共同通讯在Cell Metabolism发表题为“Skeletal muscle-derived extracellular vesiclestransport glycolytic enzymes to mediate muscle-tobone crosstalk”的文章，揭示骨骼肌来源的细胞外囊泡（Mu-EVs）运输糖酵解酶介导肌肉与骨的串扰。Mu-EVs经外周血到达骨骼进而被骨髓间充质干细胞（BMSCs）摄取，促进其成骨分化，对小鼠废用性骨质疏松症具有保护作用。

研究首先确定了培养的小鼠后肢肌肉组织上清含有丰富的EV。进一步将表达CD63的AAV 载体（MHCK7-CD63-EGFP-AAV）局部注射到小鼠后肢的双侧骨骼肌中，从这些肌肉中分离出的Mu-EV有58%可被CD63-EGFP标记（图1A），EGFP⁺EV可以在血清中被检测到，且运动后血清中富集EGFP⁺EV高于运动前，这些结果表明骨骼肌在体内分泌的EV可以进入外周血中（图1B）。

图1骨骼肌分泌丰富的EV（Mu-EV）

将MHCK7-CD63-EGFP-AAV载体局部注射到小鼠双侧后肢的骨骼肌中（图2A），发现小梁骨、皮质骨和生长板中的骨髓细胞亚群呈EGFP阳性，此外在皮质骨的微血管中也检测到荧光信号（图2B），表明Mu-EV可能通过血液循环直接转移到骨骼中。随后采用DiR标记的Mu-EV通过尾静脉注射到循环中，发现注射后1、6和24h在小鼠骨骼中检测到荧光信号，表明Mu-EV可以转运到骨组织中（图2C）。进一步将MHCK7-CD63-EGFP-AAV载体转染的骨骼肌与BMSC进行离体共培养，24h后在BMSC内观察到大量EGFP阳性颗粒（图2D）。结果表明由骨骼肌主动分泌的Mu-EV可以运输到骨骼并被BMSC吸收。

图2 Mu-EV进入骨骼并被BMSC吸收

采用茜素红S染色、碱性磷酸酶活性测定、成骨相关基因qPCR均证实Mu-EV促进BMSC成骨分化（图3A）。进一步构建了2种小鼠模型：1）跑步机运动来增加肌肉力量；2）局部注射A型肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A）诱导肌营养不良。发现两种小鼠模型后肢分离的Mu-EV形态或颗粒大小无差异，Mu-EV颗粒数量在运动后增加，在肌营养不良后减少。此外，与普通Mu-EV相比，肌营养不良组Mu-EV促进BMSC成骨效果差（图3B），而运动小鼠Mu-EV促进BMSC成骨效果更好（图3C）。表明Mu-EV的分泌和生物活性与骨骼肌功能呈正相关。此外，通过尾静脉将正常的Mu-EV注射到肌肉萎缩小鼠模型，发现Mu-EV治疗改善BoNT/A诱导的废用性骨质疏松症，运动小鼠的Mu-EV效果更好（图3D）。

用鱼藤酮激活糖酵解增强BMSC成骨分化，而用2-DG抑制糖酵解减少成骨分化，Mu-EV和鱼藤酮对增强BMSC成骨分化具有协同作用，而抑制糖酵解会阻断Mu-EV对BMSC成骨分化的促进作用（图5A、5B）。2-DG处理完全阻断了运动对骨量的积极作用运动小鼠的Mu-EV的促成骨活性，此外，Mu-EV对肌肉萎缩小鼠的治疗作用被2-DG通过抑制糖酵解所抵消。结果表明Mu-EV在体内外主要通过增强糖酵解来促进骨形成（图5C、5D）。

图5骨骼肌EV调节糖酵解促进成骨分化

前面的蛋白质组学结果显示PKM和LDHA是候选糖酵解酶，在正常Mu-EV中高表达，肌肉萎缩Mu-EV中表达减少。进一步发现运动小鼠Mu-EVs中的LDHA水平显著增加，而PKM水平保持不变，且Mu-EV治疗提高BMSC和骨组织中LDHA水平，而PKM水平保持不变。进一步siRNA敲低小鼠骨骼肌细胞系C2C12中的LDHA和PKM，发现敲低LDHA后的EV促进BMSC成骨能力较差，而敲低PKM无影响，结果表明LDHA是Mu-EV中激活BMSC糖酵解的候选蛋白。进一步利用AAV（AAV-shRNA-Ldha）在肌肉中特异性降低LDHA（图6A），发现接受AAV-sh-Ldha注射的小鼠的Mu-EV在促进葡萄糖消耗、乳酸产生以及BMSC中LDHA和成骨基因的表达方面效率较低（图6B、6C）。结果表明Mu-EVs主要通过运输糖酵解酶LDHA影响骨形成。

图6 Mu-EV通过运输糖酵解酶LDHA诱导糖酵解

研究首先发现Mu-EVs的数量和生物活性与骨骼肌功能密切相关，随后通过蛋白质组学分析显示Mu-EVs中有许多蛋白质，其中一些可能调节骨代谢，特别是糖酵解酶。进一步实验证实Mu-EVs通过将LDHA输送到骨髓间充质干细胞中，促进了骨髓间充质干细胞的糖酵解。研究为治疗废用性骨质疏松症提供了一种有希望的方法。该案例为我们开展外泌体蛋白机制研究提供了很好的参考，不同细胞之间通过外泌体进行功能分子的传递，通过组学的方法，可以实现对外泌体中功能分子的检测。

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Ma S, Xing X, Huang H, et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 2023 Nov 7;35(11):2028-2043.e7.