图1 血清SNORD46表达与肥胖和免疫抑制性肿瘤微环境相关

为了确定调节SNORD46表达的转录因子，研究人员通过PICh分析（Proteomics of isolated chromatin segments）确定了一组与SNORD46启动子区相关的转录因子（图2A），并在人脂肪细胞中逐一敲除这些转录因子，发现敲除C/EBPβ可显著抑制SNORD46的表达（图2B）。进一步ChIP（Chromatin immunoprecipitation）等实验表明C/EBPβ与SNORD46启动子区域的结合依赖于C/EBPβ磷酸化（图2C），且饱和脂肪酸可诱导人脂肪细胞中C/EBPβ T235磷酸化（图2D），并上调细胞上清中SNORD46水平（图2E）。

图2 饱和脂肪酸通过C/EBPβ诱导SNORD46表达

接下来研究人员探究了SNORD46的调控机制。采用Pulldown+MS发现SNORD46可与IL-15互作（图3A），随后通过CLIP（Cross-linking immunoprecipitation）证实了SNORD46与IL-15的结合（图3B），并鉴定了SNORD46上IL-15的结合序列（图3C）。为了确定SNORD46中与IL-15结合的关键单核苷酸，研究人员构建了一系列SNORD46突变体，发现G11C和G11U突变显著抑制野生型SNORD46与IL-15的结合，而G11A突变显著增强了SNORD46与IL-15的结合（图3D）。为了确定IL-15中与SNORD46结合的关键氨基酸序列，研究利用Lip-MS（有限蛋白水解质谱技术）发现SNORD46存在时IL-15 N端肽富集增加，表明IL-15的1-8氨基酸可能参与结合SNORD46（图3E）。进一步构建一系列IL-15 蛋白突变体发现IL-15的D8A突变抑制了与SNORD46的结合，而D8S突变增强了与SNORD46的结合亲和力（图3F）。接着，采用IL-15的晶体结构（PDB：2Z3Q）构建了RNA蛋白对接的计算模型，发现SNORD46中G11的N1能与IL-15的N65形成氢键，而N65直接与IL-15的D8结合，从而形成稳定的SNORD46-IL-15复合物（图3G）。SNORD46的G11突变为A后，羰基被胺基取代，胺基可以与IL-15的N65形成额外的氢键，从而增加了SNORD45和IL-15之间的结合亲和力（图3H）。将IL-15的D8位点突变为S后，羧酸基团被羟基取代，从而增强SNORD46和IL-15的相互作用。最后 RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）实验验证了上述计算模型（图3I，3J）。

图3 SNORD46与IL-15直接结合

IL-15可以降低肥胖小鼠WAT组织重量，研究人员通过RNA-seq技术检测发现IL-15处理显著下调了人脂肪细胞中与脂肪形成和脂肪酸代谢相关的基因表达（图4A），提示肥胖患者血清中SNORD46可能作为IL-15抑制剂，与IL-15相互作用并抑制IL-15的抗肥胖作用。由于SNORD46在人类和小鼠之间高度保守，研究人员用CRISPR-Cas9技术构建了含有Snord46基因单核苷酸变体（G11A）小鼠模型（图4B），Snord46 G11A纯和突变的小鼠（Snord46G11A/G11A）体重、体脂和脂肪组织重量显著增加（4C），结果表明SNORD46具有促肥胖作用。

图4 SNORD46和IL-15均具有促肥胖作用

研究人员通过Pulldown+MS发现在野生型小鼠的脑、心脏、肝脏、骨骼肌、脾和肠中，IL-15与IL-15Ra和JAK3结合，触发IL-15经典信号通路。而在白色脂肪组织中，IL-15与FER、MGLL和CD36结合，触发非经典信号通路。而Snord46 G11A突变显著抑制了IL5的经典与非经典信号通路（图5A）。脂肪细胞中转染Snord46 G11A突变体可以抑制IL-15与IL-2Rβ、MGLL和CD36的结合（图5B，C）， 抑制IL-15诱导的FER、MGLL和CD36的磷酸化（图5D、5E），抑制IL-15诱导的棕色化相关蛋白表达，如UCP1、PRDM16、CIDE-A、PPARγ（图5F）。总之，这些结果表明IL-15通过调控非经典信号级联反应促进脂肪分解，进而缓解肥胖，而这一现象可被SNORD46抑制。

图5 SNORD46抑制IL-15的经典和非经典信号通路

研究人员筛选到了一种抑制剂SNORD46 pi（SNORD46抑制剂#4）可特异性抑制SNORD46与IL-15的结合（图6A）。SNORD46 pi和IL-15中和抗体均可特异性抑制SNORD46与IL-15的相互作用（图6B）。此外，SNORD46 pi处理BMI＜30人群脂肪细胞，可以增强脂肪细胞对IL-15的敏感性，从而上调IL-15诱导的FER、MGLL和CD36磷酸化水平，以及UCP1、PDRM16、CIDE-A和PPARα蛋白水平（图6C）。此外，与奥利司他和利拉鲁肽（2种FDA批准的抗肥胖药物）相比，Snord46 pi治疗可显著降低Snord46G11A/G11A小鼠体重，并改善葡萄糖稳态和肝脏脂肪变性现象（图6D）。这些结果表明SNORD46 pi可能通过抑制SNORD46-IL-15的相互作用，从而缓解肥胖。

图6 SNORD46抑制剂改善肥胖

图7 血清snoRNA与IL-15结合抑制IL-15相关信号通路

本案例为我们研究非编码RNA提供了非常新颖的思路，即寻找非编码RNA的结合蛋白并开展上下游的机制研究。

值得关注的是，该文章采用了Pulldown+MS和Lip-MS的方法寻找RNA的结合蛋白，除此之外，还有其他的方法也可以寻找RNA的结合蛋白，如人类蛋白质组芯片（20K芯片）。达吉特合作案例如下：

2022年1月，浙江大学邵逸夫医院金洪传教授团队在Clin Transl Med（IF=10.6）发表lncRNA在胃癌化疗耐药中的作用机制研究，发现LINC00942通过抑制MSI2降解增强c-Myc mRNA稳定性来促进胃癌的化疗抵抗。研究使用lncRNA芯片检测发现LNC942在化疗抵抗细胞中上调最显著，进一步通过人类蛋白质组芯片筛选LNC942结合蛋白，发现LNC942与MSI2特异性相互作用，并通过RIP和RNA pull-down得到验证。机制上，LNC942与MSI2直接结合阻止其泛素化稳定MSI2，进而上调c-Myc促进化疗耐药。

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