研究首先评估了110名CRC患者及112名健康人群肠道中罗斯拜瑞氏菌的丰度，发现与健康人群相比，CRC患者粪便样本中的罗斯拜瑞氏菌显著减少（图1A）。为了进一步验证结果，作者检索了四个已发表的宏基因组数据集（包括334名CRC患者和463名健康对照）中肠道罗斯拜瑞氏菌丰度，结果显示，与健康人相比，在所有CRC患者队列中肠道罗斯拜瑞氏菌均显著减少（图1B）。

图1 CRC患者粪便中罗斯拜瑞氏菌显著减少

在ApcMin/+（小鼠自发性CRC癌前病变模型）和氧化偶氮甲烷（AOM）诱导的CRC小鼠模型、CT26或MC38异种移植小鼠模型中获得的一致结果表明，补充肠道罗斯拜瑞氏菌可以改善肠道通透性以及增强紧密连接蛋白表达，恢复肠屏障功能（图2A），最终抑制CRC小鼠肿瘤的形成（图2B）。为了研究肠道罗斯拜瑞氏菌抑制肿瘤的机制，进一步使用肠道罗斯拜瑞氏菌的培养基（CM）来处理CRC细胞（图2C）和CRC患者来源的类器官（图2D）。结果表明发现肠道罗斯拜瑞氏菌CM抑制了CRC细胞系和类器官的生长。

为了确定肠道罗斯拜瑞氏菌产生的功能性抗肿瘤分子，使用非靶向代谢组学分析肠道罗斯拜瑞氏菌培养上清，丁酸成为差异最大的代谢物之一（图3A），此外，接受肠道罗斯拜瑞氏菌补充的ApcMin/+小鼠和AOM小鼠粪便中检测到丁酸水平的升高（图3B），且丁酸可在体外抑制CRC细胞的生长（图3C）。最后对118名CRC患者和128名健康人群的粪便样本进行了代谢组学分析证实了CRC患者中丁酸的显著减少（图3D），且该队列的CRC患者中也观察到了肠道罗斯拜瑞氏菌的显著减少（图2E）。此外，从已发表的宏基因组数据集中发现与258位对免疫治疗无应答的患者相比，在75位对免疫治疗显著应答的患者的粪便中肠道罗斯拜瑞氏菌显著增多（图3F），且肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠可提高原位移植CRC小鼠中抗PD-1治疗的疗效，体现在浸润性CD8+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞（可以分泌颗粒酶B、IFN-γ及TNF-α的CD8+T细胞）均增多（图3G）。

图3 丁酸是肠道罗斯拜瑞氏菌产生的抑制肿瘤的代谢物

作者进一步研究了肠道罗斯拜瑞氏菌CM和丁酸如何与CD8+T细胞相互作用进而调节抗肿瘤免疫的机制。从人PBMC或小鼠脾脏中分离T细胞，对其进行或不进行肠道罗斯拜瑞氏菌CM或丁酸处理，结果显示肠道罗斯拜瑞氏菌CM和丁酸处理均促进了CD8+ T细胞产生颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α（图4A），为了了解它们与CD8+T细胞的机制关联，在CM处理后检查CD8+ T细胞上受体和转运蛋白（包括 GPR43、SLCL6A1和TLR1-6）的mRNA表达，发现CM促进CD8+ T细胞上受体和转运蛋白的mRNA表达，包括GPR43、SLCL6A1和TLR1-6。特别是TLR5的mRNA表达量显著增高10倍以上，且丁酸处理同样增加TLR5表达（图4B）。随后通过Pull-down（图4C）、SPR（图4D）、分子对接（图4E）显示丁酸可以自发地结合至TLR5受体的活性口袋。使用选择性TLR5拮抗剂TH1020来抑制CD8+T细胞中的TLR5信号传导，消除了丁酸诱导的T细胞增强反应（图4F）。NF-κB信号传导被认为是TLR5的下游通路，丁酸促进了CD8+ T细胞中NF-κB（p65）的核转位及磷酸化蛋白表达水平，而TH1020逆转了这种增加（图4G）。

图4 丁酸直接靶向TLR5增强CD8+ T细胞的功能

总之，肠道罗斯拜瑞氏菌产生的丁酸通过直接结合CD8+ T细胞上的TLR5受体激活TLR5-NF-κB途径进CD8+ T细胞的活化（图5）。

图5 作用机制模式图

该案例作为肠道微生物研究的一个经典案例，研究思路如下：

1） 临床样本确定结直肠癌与健康对照的粪便中肠罗斯拜瑞氏菌的丰度差异；

2） 多种CRC小鼠模型、细胞模型和类器官模型确定罗斯拜瑞氏菌显著抑制肿瘤形成并恢复肠道屏障功能的功能；

3） 代谢组学检测罗斯拜瑞氏菌培养上清确定丁酸是肠道罗斯拜瑞氏菌产生的抑制肿瘤的代谢物；

4） Puldown、SPR、分子对接等技术确定丁酸直接与CD8+ T细胞上的TLR5受体结合，并通过激活NF-κB信号传导提高细胞毒性CD8+ T细胞的功能。

研究首先确定肠道差异菌群，随后确定其分泌的差异代谢物，最后确定了代谢物的直接作用靶点及功能机制，而人类蛋白质组芯片，DARTS/Pulldown+质谱、SPR等技术是实现代谢物靶点的筛选和验证的常见研究手段。

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