目前用于结直肠癌（CRC）筛查的粪便测试（粪便免疫化学试验，FIT）对于早期肿瘤或癌前病变的检测准确性有限。肿瘤分泌的miRNA直接和连续地释放到肠腔中，它们的表达水平可能会随着结直肠癌和癌前病变的存在而改变。miRNA非常稳定，可在粪便中准确检测它们，基于粪便样本的研究发现了与CRC相关的少量miRNA，但这些研究通常是在小群体中开展，没有考虑人口统计学特征、不同的生活方式和饮食习惯。此外，粪便miRNA谱与患者临床病理特征相关的证据有限。因此，研究人员开展的多中心研究全面评估了粪便miRNA谱作为非侵袭性CRC早期诊断生物标志物的临床价值和检验效能。

本项多中心研究旨在通过深度测序探索粪便样本中的miRNA图谱，这些图谱能够表征CRC患者与对照个体的特征，并区分结直肠腺瘤或其他胃肠道疾病。这些分析是在不同的独立队列中进行的，采用相同的方案进行参与者招募、样本收集和miRNA测序实验/分析。

|   实验方法

1、发现集和验证集确定miRNA特征诊断效果

在两个发现队列中，每个样本中平均检测到479种miRNA，与对照相比，结直肠癌患者的粪便中检测到25个显著差异的miRNA（图1A）。进一步机器学习建立用于CRC诊断的的5个miRNA特征（包括 miR-3-607p、miR-5-1246p、miR-4488、miR-6777和miR-5-0p）能够将区分患者与对照组（AUC=0.86，95% CI=0.79-0.94），并在在第三个队列中验证了该特征，独立队列中得到验证（AUC=0.96, 95% CI=0.92-1.00）（图1B）。

图1 发现集和验证集确定miRNA特征诊断效果

2、miRNA特征可区分低/高分期肿瘤和晚期腺瘤

研究进一步将该miRNA特征在不同分期的CRC粪便样本中的诊断效能，发现粪便miRNA可区分低/高分期肿瘤和晚期腺瘤（AUC=0.82, 95% CI=0.71-0.97）（图2）；

图2 miRNA特征对不同分期CRC的诊断效果

3、粪便MicroRNA谱在其他胃肠道疾病中存在差异

进一步研究发现，粪便差异表达的miRNA谱与原发性结直肠癌和腺瘤组织的谱相似，即粪便样本的miRNA谱反映了组织miRNA谱（图3A），而不同胃肠道疾病的粪便谱（CRC、结直肠腺瘤、增生性息肉或其他胃肠道疾病患者）突出了CRC有明显特异性失调的miRNA谱（图3B）。此外，FIT剩余样本中的miRNA谱与在防腐保存缓冲液中收集的粪便的miRNA谱具有良好的相关性，并且可以在腺瘤或CRC患者中检测到其改变（图3C）。

图3 粪便MicroRNA谱在其他胃肠道疾病中存在差异

值得注意的是，研究还使用与粪便和组织样本相同的实验方法，探索了研究人群子集的血浆EV的miRNome。然而，在这个210例血浆EV样本中，少数 miRNA显示出与粪便中相似的趋势。例如，在5种特征miRNA中，与对照组相比，CRC患者血浆EV中的miR-1246和miR-4488水平显著升高，和粪便中出现了一致性显著失调。尽管需要更多数据来比较粪便和血浆EV miRNA，但考虑到已有研究报道了EV中miR-1246水平与CRC转移之间的关系，这些循环分子可能为疾病晚期提供更多信息。

关于miRNA含量：在发现集和验证集的粪便样本中分别平均鉴定到421±222、440±217种miRNA，在组织样本中平均鉴定到581±173种miRNA，在血浆EV中平均鉴定到309±90种miRNA。

如何进一步优化结直肠癌的非侵袭性筛查策略一直是备受关注的科学问题。Gastroenterology的这项多中心研究综合粪便miRNome分析确定了一个准确区分CRC的特征，为改善非侵袭性诊断和筛查策略提供了新的线索。外泌体携带的内容物（核酸、蛋白、代谢物等）可反映疾病的病理特征，并揭示疾病的发病机制，综合的蛋白质组学或RNA组学策略对其它疾病的生物标志物研究同样适用。

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