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Nature和Cell子刊共同关注:分泌蛋白直接作用靶点的发现与机制研究策略

Nature和Cell子刊共同关注:分泌蛋白直接作用靶点的发现与机制研究策略

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号

【概要描述】分泌因子介导的细胞间对话在机体代谢稳态调控和代谢性疾病的病理进程中发挥关键作用。

Nature和Cell子刊共同关注:分泌蛋白直接作用靶点的发现与机制研究策略

【概要描述】分泌因子介导的细胞间对话在机体代谢稳态调控和代谢性疾病的病理进程中发挥关键作用。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:小高
  • 来源:达吉特公众号
  • 发布时间:2023-08-16 14:36
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肥胖及其相关代谢性疾病如II型糖尿病的发病率不断增加,日益成为危害人类健康的重大慢性疾病。越来越多的研究提示,分泌因子介导的细胞间对话(Crosstalk)在机体代谢稳态调控和代谢性疾病的病理进程中发挥关键作用。骨骼肌是人体最大的运动和代谢器官之一,同样也是重要的内分泌器官,合成和分泌数百种肌细胞因子(Myokines),如Musclin、Irisin等,通过自分泌、旁分泌和内分泌机制调节全身能量代谢和葡萄糖稳态。然而,这些骨骼肌分泌因子在代谢组织重塑和能量稳态调控中的作用及其潜在作用机理仍知之甚少。

|   01、分泌因子Musclin通过Tfr1/PKA信号抑制米色脂肪产热调控全身代谢稳态

2023年7月,浙江大学基础医学院孟卓贤研究员团队和浙江大学医学院附属儿童医院傅君芬教授团队合作在Nature Communication(IF=16.6)发表题为“The muscle-enriched myokine Musclin impairs beige fat thermogenesis and systemic energy homeostasis via Tfr1/PKA signaling in male mice”的文章,揭示骨骼肌分泌因子Musclin抑制脂肪细胞产热代谢,调控全身能量平衡的新机制。

1、Musclin是促进肥胖及其相关代谢性疾病发生的重要风险因子

研究首先通过转录组学分析差异的编码分泌因子的基因,筛选到在肥胖患者的人骨骼肌样本显著上调且在骨骼肌中特异性高表达的分泌因子Musclin(图1A、B)。进一步利用大样本人群以及肥胖和T2D小鼠模型的骨骼肌和血液样本,发现Musclin在肥胖T2D患者和小鼠骨骼肌和血液显著高表达(图1C、D),提示Musclin可能是促进肥胖及其相关代谢性疾病发生的一个重要风险因子。

图1 Musclin在肥胖患者和小鼠组织和血浆中上调

2、过表达和敲低实验确定Musclin的抑制产热功能

研究运用SEAP-Musclin结合实验发现皮下白色脂肪组织为Musclin作用的主要部位(图2A)。进一步构建Musclin过表达小鼠发现,肌肉转基因或AAV介导的Musclin过表达会减弱米色脂肪产热,从而加剧雄性小鼠饮食诱导的肥胖和代谢紊乱(图2B)。相反,骨骼肌特异性Musclin基因敲除小鼠和Musclin中和抗体处理小鼠模型,使Musclin失活促进米色脂肪产热并改善雄性小鼠的代谢稳态(图2C)。利用体外细胞模型(C3H10T1/2分化的米色脂肪细胞)确定了Musclin蛋白对于米色脂肪细胞氧气消耗率及糖脂代谢和产热基因表达的直接抑制效果,并且发现Musclin的抑制产热功能依赖于cAMP/PKA信号通路(图2D)。

图2 Musclin的抑制产热功能

3、Musclin的直接作用靶蛋白

近年来,临近标记技术正在被逐渐应用到蛋白质相互作用的研究中。其原理是在已知蛋白上融合一个具有临近标记功能的酶,通过酶介导的蛋白质共价修饰将与已知蛋白相互作用的蛋白标记上生物素,从而使原本不易被检测的相互作用蛋白被发现和鉴定。目前常用的临近标记技术包括:1)BioID方法(biotin ligase,生物素连接酶);2)APEX方法(peroxidase,过氧化酶);3)PUP-IT方法(Pup连接酶PafA)。

研究人员通过临近蛋白生物素标记技术(BioID)结合质谱技术分析处理组与对照组细胞膜上被Biotin标记的差异蛋白(图3A,发现Musclin在产热脂肪细胞上的新受体Tfr1(转铁蛋白受体1)(图3B),并通过COIP等手段进行了验证(图3C、3D)。最后利用Tfr1基因敲低小鼠模型等多种体内外研究手段,确定Tfr1调控米色脂肪细胞中cAMP/PKA信号通路,介导了Musclin对其产热代谢功能的选择性调控作用(图3E-3H)。

图3 Musclin的直接作用靶蛋白

总之,研究从人群样本出发,筛选并发现骨骼肌分泌因子Musclin在肥胖患者骨骼肌和血液循环中显著高表达。进而从正反两方面证明了其通过抑制米色脂肪细胞产热代谢、降低机体能量消耗,在全身糖脂代谢稳态调控中发挥重要作用。此外,该工作首次发现并确定了Musclin在产热脂肪细胞膜上的作用受体Tfr1,及其下游cAMP/PKA依赖的信号转导途径,为肥胖及其相关代谢性疾病的诊治提供了潜在新型生物标志物和干预新靶点。

|   02、分泌因子鸢尾素与整合素结合诱导细胞内FAK磷酸化和其他信号通路激活

鸢尾素(Irisin)是一种由肌肉细胞在运动时分泌的激素,它可以调节身体的能量代谢和神经系统的功能。近年来,鸢尾素的研究引起了科学界和公众的广泛关注,因为它具有预防和治疗多种代谢和神经退行性疾病的潜力。2012年哈佛大学的布斯塔曼教授等人在Nature发表了一篇重要的论文,报道了PGC1α可以诱导肌肉细胞分泌一种名为FNDC5的膜蛋白,而FNDC5在血液中被剪切成一种可溶性的激素,即鸢尾素。他们还发现,运动可以提高人类和小鼠体内鸢尾素的循环浓度,而注射鸢尾素可以模拟运动的部分效应,如增加能量消耗和改善胰岛素敏感性,治疗人类代谢疾病2018年,该团队后续的Cell发文揭示鸢尾素主要通过与整合素αVβ5受体相互作用,在骨骼肌、脂肪组织和海马中发挥重要作用。然而irisin如何与整合素受体相互作用并产生效应尚不清楚。

2023年6月,该团队继续在 Molecular Cell(IF=16.0)发表题为“Irisin acts through its integrin receptor in a two-step process involving extracellular Hsp90α”的文章,揭示Hsp90α、以及鸢尾素与整合素的相互作用对鸢尾素活性的调控,这些发现有助于揭示鸢尾素的功能机制,并为基于Irisin的治疗药物的开发提供了重要信息。

1、鸢尾素与整合素αVβ5结合需要 eHsp90a

研究首先通过BLI技术证实鸢尾素与整合素αVβ5的结合(图4A),但当提高αVβ5蛋白的纯度时,鸢尾素与αVβ5的结合能力消失(图4B),表明αVβ5中可能混入了相似分子量的杂蛋白,与αVβ5共纯化的蛋白质是鸢尾素和αVβ5之间的高亲和力结合所必需的。采用质谱分析确定了该蛋白主要为Hsp90a(图4C)。进一步使用荧光偏振技术发现αVβ5对鸢尾素的亲和力非常低,而αVβ5/Hsp90a复合物以更高的亲和力结合鸢尾素(图4D)。结果表明Hsp90a被鉴定为来自培养的哺乳动物细胞的细胞外因子,通过直接与αVβ5结合来介导鸢尾素/αVβ5相互作用。

图4 鸢尾素与整合素αVβ5结合需要 eHsp90a

2、eHsp90a水平随着肌肉锻炼而增加并且是鸢尾素发挥最佳细胞作用所必需

由于鸢尾素水平会随着运动而增加,研究同样运动后休息不同时间的小鼠肌肉组织间质液(图5A)和血浆中(图B)eHsp90a蛋白水平也上调而肌肉组织内的Hsp90a蛋白总水平保持不变(图5C)。进一步研究人员使用HEK293T细胞和黑素瘤细胞开展功能实验,结果显示Hsp90α能够与整合素αVβ5结合(图5D),同时Hsp90α的存在增强了鸢尾素与整合素αVβ5的结合,进而诱导细胞内FAK的磷酸化和其他信号通路的激活(图5E)。综合来看,Hsp90α在调节鸢尾素与其受体的结合及下游信号通路中具有重要作用。

图5 eHsp90a随锻炼增加并且是鸢尾素发挥作用所必需

3、Hsp90a 激活aVb5进而与鸢尾素结合

研究进一步采用cryo-EM技术观察Hsp90和αVβ5的构象状态,并通过荧光吸附实验比较了不同条件下鸢尾素与整合素的结合亲和力(图6A),结果表明Hsp90主要起到打开αVβ5的结构状态从而促进鸢尾素与其结合的作用。此外,研究还对鸢尾素和整合素复合物的生物物理特性进行分析,通过MST(图6B)和氢/氘交换质谱(HDX-MS)(图6C)等技术发现其与与其他整合素配体不同,鸢尾素可能在与整合素结合时具有非常独特的作用机制。接着研究构建了一个鸢尾素/αVβ5复合物的原子分辨率模型,并通过多步MD模拟进行了精细修正(图6D)。结果表明,鸢尾素与其他FNIII结构域结合蛋白的结合位点完全不同,因此它们不会与鸢尾素竞争与αVβ5的结合。最后研究通过荧光偏振技术验证了鸢尾素/αVβ5复合物模型(图6E)。

图6  Hsp90a 激活αVβ5进而与鸢尾素结合

综上,文章揭示了eHsp90α可以结合αVβ5,并通过改变其构象使其激活,进而允许鸢尾素通过非常规的高亲和力位点结合αVβ5,并通过Hsp90α/αVβ5复合物进行信号传递,这为我们了解鸢尾素的作用机制提供了新的见解。

 

|   总结与讨论

2023年7月,斯坦福大学医学院在Cell Metab(IF=29.0)上发表文章绘制了泛器官细胞类型特异性分泌蛋白图谱,深入研究小鼠运动之后10个组织21种细胞的蛋白分泌情况,发现运动改变了256个细胞类型-分泌蛋白对,涉及181种变化的分泌蛋白(上调或下调),很多之前都没有被报道过。其中羧酸酯酶CES2A和CES2C在运动后分泌量增加了3倍,已经有研究发现它们在肝脏的过表达可以抗肥胖、抗脂肪变性和抗糖尿病。此外,另一个分泌蛋白TIMP3运动后分泌量增加了17倍,很多研究发现它与肌肉生成、产热/代谢、血管重塑和动脉粥样硬化有关。

血液或组织间质液中均存在大量的分泌蛋白,这些蛋白发挥什么样的作用,和哪种靶蛋白发生直接相互作用,激活细胞内的哪些信号通路,都是值得深入研究的问题。

两篇文章均发现肌肉和血浆中的分泌蛋白能够发挥改善代谢的作用,并阐明了其直接互作的蛋白,均为膜蛋白,并找到了下游的信号通路,为我们开展分泌蛋白(各种细胞因子如肌肉激素、白介素等)的作用机制研究提供了很好地思路。

关于分泌蛋白的功能机制研究,达吉特可以助您实现:

1) 通过蛋白质组学或蛋白芯片技术实现对分泌蛋白的确定;

2) 通过pulldown、20K芯片等技术实现对分泌蛋白的互作蛋白的筛选;

3) 通过SPR、MST等技术实现对分泌蛋白与互作蛋白的验证;

4) 通过磷酸化抗体芯片实现对胞内相关信号通路的筛选;

 

达吉特专注于药靶研究,可为您寻找药物靶点提供多种多样的专业的技术服务和解决方案,助您解决药物靶点-机理研究中的各种难题。 

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达吉特针对于中药及小分子药物研究,建立了一套完整的技术服务体系:

1)中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定;

2)血清/组织药代动力学分析

3)小分子化合物生物素批量标记

4) 小分子靶点筛选:20K芯片,DARTS/Pull down+质谱

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6)网络药理学与计算机分子对接

7)SPR表面等离子共振(分子动力学)

8)天然产物化合物库与功能化合物筛选服务

|   相关文献

[1] Jin L, Han S, Lv X,et al. The muscle-enriched myokine Musclin impairs beige fat thermogenesis and systemic energy homeostasis via Tfr1/PKA signaling in male mice. Nat Commun. 2023 Jul 19;14(1):4257.

[2] A M, Wales TE, Zhou H,et al. Irisin acts through its integrin receptor in a two-step process involving extracellular Hsp90α. Mol Cell. 2023 Jun 1;83(11):1903-1920.e12.

[3] Wei W, Riley NM, Lyu X,et al. Organism-wide, cell-type-specific secretome mapping of exercise training in mice. Cell Metab. 2023 Jul 11;35(7):1261-1279.e11.

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