外泌体作为脂质双层膜囊泡，可将脂质、蛋白质、mRNA 和 miRNA等传输到受体细胞并调控相关生理过程，例如免疫稳态和自身免疫。强直性脊柱炎（AS）是一种脊柱自身免疫性炎症性疾病，AS 患者血浆来源的外泌体中的蛋白质和miRNA表达鲜有研究报道。

2023年8月，加拿大多伦多大学研究人员在Ann Rheum Dis（IF=27.4）上发表题为“Proteomic and genomic profiling of plasma exosomes from patients with ankylosing spondylitis”的文章，研究对AS患者中血浆来源的外泌体进行蛋白质组学和miRNA分析，确定AS患者具有不同的免疫学特征，并揭示AS血浆外泌体中异常的miRNA表达可能通过干扰效应T细胞和Treg细胞的稳态而促进AS的发病机制。

研究纳入40例AS患者，28例健康对照（HC），开展如下分析：

1）超速离心分离AS和HC的血浆样本，通过多重免疫捕获测定来表征外泌体表面标记物；

2）对血浆外泌体和细胞培养上清液进行多重细胞因子测定：IL-1β、IFN-α2、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-6,IL-8,IL-10，IL-12p70，IL-17A，IL-18，IL-23和IL-33；

3）通过Qiagen试剂盒提取外泌体RNA开展血浆外泌体miRNA测序；

4）分选CD4+ T细胞并使用流式细胞术分析AS外泌体处理后CD4+T细胞亚群的比例。

1、外泌体表面蛋白

采用MACSPlex人外泌体试剂盒检测37个表面蛋白，结果显示所有外泌体样本均显示外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81，但与HC组相比，AS组检测到的CD63和CD81表达显著增加。其它外泌体表面蛋白表达水平无显著差别。此外，HLA-ABC、CD40、CD62P、CD42a、CD31的强信号表明其白细胞、血小板和内皮细胞起源（图1A、B）。

2、血浆来源的外泌体和细胞培养上清液的细胞因子

为了探索AS-外泌体和HC-外泌体之间细胞因子表达的差异，使用LEGEND plex Human Inflammation Panel测量13种细胞因子，发现IL-33、IFNγ、TNFα、IL6和IL-12p70在HC-外泌体和AS-外泌体上均高表达，并且这些细胞因子的表达在AS组和HC组之间没有差异。而与HC-外泌体相比，AS-外泌体中的IL-8和IL-10显著下调（图2A）。将HC的CD4+ T细胞与AS-外泌体共培养72小时，发现HC的CD4+T细胞中IFNα2和IL-33上调，而HC-外泌体与HC CD4+T细胞共培养时无此现象（图2B）。由于AS是一种炎症性疾病，AS外泌体表达IL-10减少（IL-10，一种免疫抑制性细胞因子，可抑制IL-12、TNFα等炎性细胞因子的产生从而有助于宿主免疫耐受），免疫调节能力降低，这可能为慢性炎症发生奠定基础。此外，有研究报道IL-33可以被视为AS进展中的生物标志物，表明外泌体衍生的细胞因子可能作为生物标志物，但在临床实践中使用外泌体衍生的细胞因子作为生物标志物需要更大规模的研究。

图2 外泌体和细胞上清中细胞因子检测

3、AS-外泌体携带独特的miRNA特征

对17例AS患者和10例HC，进行外泌体miRNA测序，共有24个miRNA在AS与HC外泌体中差异表达，其中，有2个miRNA下调（hsa-let-7b-5p和hsa-let-7c-5p），22个miRNA上调（hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-93-5p等）（图3）。

图3 外泌体miRNA测序

hsa-miR-330-5p在HLA-B27阴性的患者例表达上调（图4A），比较男性和女性AS患者的miRNA表达量时，发现hsa-let-7b-5p和hsa-let-7c-5p在男性AS患者中表达升高（图4B、C）。

图4 外泌体miRNA与临床表型关联

4、功能富集分析

GO分析发现24个miRNA与细胞粘附分子结合、DNA结合转录激活相关。通路分析显示差异miRNA参与的前5条通路如下：染色质修饰酶、染色质组织、MAPK家族信号级联、PIP3激活AKT信号和翻译后蛋白修饰。这项研究的目标包括确定外泌体miRNA如何影响T细胞活性，因为持续的T细胞激活是AS慢性炎症的基础。研究重点关注CD4+ T细胞和Treg细胞中的翻译后修饰。差异表达miRNA中，miR 30c-5p 是GO和通路分析中排名前5的miRNA，在翻译后修饰和染色质类别方面具有最多的靶标数量（图5）。特别是IRF4是miR-30c-5p的潜在靶标，而IRF4是效应Treg细胞发育的重要转录因子。

5、AS-外泌体抑制 CD4+ T 细胞和 Treg 细胞增殖

与HC-外泌体相比，用AS-外泌体培养后，CD4+ T细胞和Foxp3+CD4+Treg细胞的增殖显著降低（图6A、B）。此外，用AS-外泌体培养后，来自HC的CD4+ T细胞miR-30c-5p显著上调（图6C）。AS-外泌体还能够降低FOXP3+IRF4+ Treg 细胞和FOXP3+IRF4+CTLA4+ Treg 细胞比例（图6D、F），而将CD4+ T细胞转染miR-30c后，观察到 FOXP3+IRF4+ Treg细胞的比例的降低（图6E）。

图6 AS-外泌体抑制 CD4+ T 细胞和 Treg 细胞增殖

外泌体携带的内容物（核酸、蛋白、代谢物等）可反映疾病的病理特征，并揭示疾病的发病机制。该研究首次对AS血浆来源的外泌体进行蛋白质组学和miRNA分析，通过评估这些患者的外泌体可以确定AS患者具有不同的免疫学和遗传特征，包括血浆来源的AS外泌体中的特定细胞因子和miRNA改变，并揭示了患者可能通过外泌体miRNA发挥Treg的抑制作用导致疾病中T细胞长期激活的机制。

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