质谱流式细胞术(CyTOF)是用金属同位素连接的抗体作为标签，对单细胞靶蛋白进行标记，再经过飞行时间质谱的检测，从而达到单细胞蛋白质表达特征分析的目的。和传统的荧光流式相比，质谱流式的优势在于：1. 通道间的干扰可以忽略不计，无需进行补偿计算。2. 单次上机可以到达40多个蛋白质指标的检测，能够实现精细的细胞分型。 

2023年3月，西南医院病理研究所卞修武院士团队在Cancer Cell发表题为“Neutralizing IL-8 potentiates immune checkpoint blockade efficacy for glioma”的文章，发现细胞因子IL-8促进脑胶质瘤小鼠肿瘤微环境的免疫抑制状态，削弱抗PD-1免疫检查点治疗的疗效，可以作为联合免疫治疗的潜在靶点。

目前神经胶质瘤的免疫检查点治疗疗效较差，可能的原因包括胶质瘤细胞的内在特性，如其巨大的遗传异质性和低突变负担，以及外在因素，主要是胶质瘤受髓样细胞影响形成的高度免疫抑制性微环境。目前有越来越多的研究表明肿瘤浸润T细胞的异质性和功能状态在抗肿瘤免疫和免疫治疗反应中具有关键作用，本研究利用质谱流式(CyTOF) 联合单细胞测序(scRNA-seq)对配对的人血液和肿瘤组织中的T细胞进行了免疫图谱绘制。

纳入样本来自152个胶质瘤患者的外周血和胶质瘤组织，其中51个患者病况较轻，属于低病理级别（LGG），另外101位患者属于高病理级别（HGG）。

| 主要实验步骤：

1. 对包括LGG和HGG的71个病人的胶质瘤组织样本进行H＆E和IHC染色，进行肿瘤组织T细胞定位。

2. 利用CyTOF技术检测14例病人样本的外周血和胶质瘤组织（其中包含5对匹配的外周血组织样本）的T细胞标志物和趋化因子受体蛋白。

3. 采用细胞分选的方式提取5对匹配的胶质瘤组织和外周血PBMC样本中的116,205个 T细胞(65990个细胞来源于PBMC，50215个细胞来源于肿瘤组织)，并进行T细胞受体测序（scTCR-seq）。

4. 构建人源化IL-8胶质瘤小鼠实验验证模型。

|   03、主要实验结果

CyTOF检测了16个趋化因子受体和免疫细胞表面标志物（CCR6-141Pr, CCR5-144Nd, CD8-146Nd, CD45RA-153Eu, CD3-154Sm, CXCR3-156Gd, CCR4-158Gd, CD45RO-165Ho, CD25-169Tm, CD4-174Yb, PD-1-175Lu, TCRgd-152SM, CD19-142Nd, CD56-155Gd, CX3CR1-172Yb, LAG3-150Nd），分析对比显示胶质瘤组织中CD4+T和CD8+T细胞的趋化因子受体CCR5和CXCR3，耗竭性marker PD-1和Treg标志物的表达显著高于外周血样本，说明:

1.CCR5和CXCR3胶质瘤组织中引导T细胞迁移的重要受体。

2.胶质瘤组织中的CD4+T和CD8+T细胞整体倾向于免疫功能障碍的耗竭性状态（PD-1+）。

3.胶质瘤组织中免疫抑制性T细胞Treg浸润较为丰富。

scTCR-seq分析鉴定出18种T细胞亚群，包括7种CD4+T细胞，10种CD8+T细胞和1种γ/δT细胞。进一步分析发现CCR5和CXCR3在肿瘤驻留性T细胞中广泛表达，并且CCR5+CXCR3+CD4+T和CCR5+CXCR3+CD8+T细胞包括IFNG和TNF等肿瘤杀伤性细胞因子基因高表达。说明这两种趋化因子受体介导T细胞向肿瘤的转移并且CCR5+CXCR3+ CD4+T/CD8+T参与肿瘤免疫杀伤，同时scTCR-seq分析发掘出了一种含量较高的IL-8高表达CD4+T细胞亚群(Th8)，拟时序分析显示终末分化状态的CD4+T细胞IL-8高表达。

荧光流式检测表明胶质瘤组织中的IL-8主要在CXCR5-CD4+T细胞分泌，同时结合癌症基因组图谱(TCGA)数据库发现IL-8高表达会造成预后不良。

后续的功能分析结合小鼠动物模型验证表明肿瘤细胞分泌的刺激因子促进IL-8分泌T细胞分化， IL-8因子可以募集免疫抑制性的髓样抑制性细胞(MDSC)并促进血管生成，增强胶质瘤组织血管免疫微环境的免疫抑制状态，对IL-8-CXCR1/CXCR2通路的封闭可以有效的增强抗PD-1免疫治疗的疗效。