外泌体是由细胞分泌的直径在30~150nm的膜性小囊泡，外泌体参与神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，由于它们含有丰富的生物标志物，可用于监测疾病进展，治疗反应等，同时由于外泌体具有携带递送生物分子的功能，具有成为临床药物递送载体的潜力。外泌体的功能研究第一步，即外泌体的鉴定。

国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年提议，对于分离获得的外泌体需要进行三项鉴定：

1.Western Blot（WB）鉴定外泌体表面标志物；

2.透射电镜（TEM）鉴定外泌体形态；

3.粒径分析（NTA）鉴定外泌体大小。

一、WB：检测外泌体标志蛋白的表达情况

鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样品中。

外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常用到的细胞外囊泡标志物。

这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，如四旋蛋白（CD9，CD63和CD81），直接参与了细胞外囊泡内容物的分选。

二、电镜：分析外泌体的大小/形态等

透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)等电子显微镜可用于外泌体鉴定。TEM是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。

外泌体透射电镜分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，可观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，如图）同时可测量外泌体大小。

三、纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)检测外泌体粒径及浓度

在外泌体研究领域，NTA技术已被用作外泌体表征手段之一；相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单，更能保证外泌体原始状态，检测速度更快。

大致方法是：将收集的外泌体用PBS稀释至106/mL，用1 mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪(如装有450 nm激光器的Nanosight NS300颗粒粒度分析仪)；激光光束穿过样本室外泌体颗粒，通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉外泌体的布朗运动，利用爱因斯坦方程式根据其运动计算浓度和流体力学直径。

华盈生物可提供外泌体三项鉴定以及外泌体蛋白组学等服务助您解决外泌体研究中的各种难题。