不到50%的主动脉瓣钙化患者伴有动脉粥样硬化，这意味着发病机制不同。尽管循环细胞外囊泡（EV）是心血管疾病的生物标志物，但它们的内容物、功能和对疾病的贡献仍然未知。

2023年7月10日，哈佛医学院研究人员在Circulation（IF=37.8）上发表题为 “Multiomics of Tissue Extracellular Vesicles Identifies Unique Modulators of Atherosclerosis and Calcific Aortic Valve Stenosis”的文章，针对人类颈动脉斑块和钙化主动脉瓣的组织细胞外囊泡开展蛋白质组学和miRNA测序，整合囊泡组学策略揭示了组织EV在调节心血管疾病中的新作用。

1）纳入三个不同分期的人颈动脉内膜切除标本（n=16）和狭窄主动脉瓣（n=18）进行组织蛋白质组学分析。

2）纳入人颈动脉（正常，n=6；患病，n=4）和主动脉瓣（正常，n=6；患病，n=4）分离出组织EV，开展组织EV蛋白质组学和miRNA测序，TargetScan识别出miRNA靶标，通路网络分析优先基因，以在原代人颈动脉平滑肌细胞和主动脉瓣间质细胞中进行功能验证。

1）组织蛋白质组学发现血管和瓣膜疾病进展之间EV相关蛋白表达的保守性

对颈动脉斑块（3个不同分期的样本各16例）和钙化主动脉瓣组织（3个不同分期的样本各18例）开展组织蛋白质组学，共检测到2348个蛋白质（图1A），每个组织保留了差异富集蛋白质的独特子集（斑块中381个；瓣膜中226个），颈动脉斑块和瓣膜组织共有120个差异蛋白（图1B）。这120个蛋白经过GO分析主要与囊泡密切相关（图2C、2D），通路分析发现这些蛋白与脂蛋白重塑、适应性免疫/抗原呈递、自噬/吞噬作用有关。此外，在组织消化物中鉴定出了22个EV标志物。结果表明，EV相关功能在颈动脉斑块和钙化主动脉瓣发病机制中高度存在，促使研究人员分离并研究这些组织EV的内容物。

图1 组织蛋白质组学分析

2）组织EV的蛋白质组学特征及其与组织蛋白质组学特征相关性

收集颈动脉（6例正常颈动脉，4例颈动脉粥样硬化斑块患者）和主动脉瓣组织（6例正常主动脉瓣，4例钙化主动脉瓣患者），分离EV（图2A），开展组织EV蛋白质组学，检测到1942个蛋白质，其中颈动脉斑块组织EV中检测主动脉瓣到差异蛋白525个特有差异蛋白、瓣膜组织EV中检测到248个特有差异蛋白，颈动脉斑块和瓣膜组织EV共有404个差异蛋白（图2B）。KEGG通路富集显示，404个共有的差异EV蛋白主要与白细胞跨内皮迁移、脂解/脂肪酸降解、糖异生和丙酮酸代谢密切相关（图2D）。此外，组织中检测到的蛋白与组织EV中检测到的蛋白的表达水平存在很强的正相关性（图2C）。

图2 组织EV蛋白质组学分析

3）组织EV的miRNA组学特征

收集上述开展EV蛋白质组学的同批次的对应的样本，即颈动脉（6例正常颈动脉，4例颈动脉粥样硬化斑块患者）和主动脉瓣组织（6例正常主动脉瓣，4例钙化主动脉瓣患者），开展组织EVmiRNA测序（图3A），检测到1083个miRNA，其中颈动脉斑块组织EV中检测主动脉瓣到44个特有差异miRNA，瓣膜组织EV中检测到36个特有差异miRNA，颈动脉斑块和瓣膜组织EV共有26个差异miRNA（图3B）。TargetScan 7.2预测miRNA的mRNA靶标（图3C），KEGG通路富集显示，26个共有的差异EV miRNA主要与蛋白质消化和 TNF、NFκB和 TLR通路密切相关（图3D）。

图3 组织EV的miRNA测序分析

4）组织EV蛋白和miRNA整合分析保守的心血管EV内容物

EV多组学数据在通路水平进行整合，将EV 蛋白质组和EV miRNAome的基因靶标共有的50条通路组装成通路网络，通路网络内的功能群落揭示疾病改变的EV共享4个不同的注释，包括细胞内信号级联的调节、细胞周期调节和细胞凋亡、蛋白质加工和囊泡运输以及ECM 合成和组织，表明心血管组织EV内可能会调节患病组织中受体细胞的细胞内信号传导，而通路网络表明 EGFR和雌激素信号传导是一种关键的共同疾病驱动的组织EV的分子成分（图4A）。此外，颈动脉或瓣膜中疾病改变的EV蛋白和EV miR的基因靶标中分别富集了27条和29条重叠的KEGG/Reactome/BioCarta通路，蛋白质-蛋白质相互作用网络表明它们参与钙化。其他途径中，EV在颈动脉和瓣膜中分别携带促进钙化的Notch和Wnt信号相关的组织特异性分子（图4B），而敲低人颈动脉平滑肌细胞中的组织特异性EV蛋白，如FGFR2、PPP2CA 和ADAM17以及人主动脉瓣膜间质细胞中的WNT5A、APP和APC可显著调节钙化。

图4 组织EV蛋白和miRNA整合分析

研究首先开展了组织的蛋白质组学，发现EV相关功能在颈动脉斑块和钙化主动脉瓣发病机制中高度存在，促使研究人员分离颈动脉斑块和钙化主动脉瓣组织中的EV，进一步开展了组织EV的蛋白质组学和miRNA测序分析，通过网络方法整合囊泡蛋白质组学和转录组学揭示了组织 EV 在调节心血管疾病中的作用，确定了动脉粥样硬化与主动脉瓣狭窄的独特驱动因素，并表明EV与晚期心血管钙化有关。值得注意的是，组织中检测到的蛋白与组织EV中检测到的蛋白的表达水平存在很强的正相关性。

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