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中药活性成分的直接靶点筛选与验证技术有哪些?

中药活性成分的直接靶点筛选与验证技术有哪些?

【概要描述】随着化学蛋白组学技术的发展,越来越多的方法被建立并用于中药活性成分的靶点鉴定。简单来说,这些方法大致可被分为两类:1)标记法:通过化学改造,将中药活性成分改造成具有标记的探针,进而通过荧光成像或富集技术,对其靶蛋白进行鉴定。2)非标记法:不需要对中药成分进行修饰,基于中药活性成分和靶标蛋白结合后会影响靶标蛋白的热稳定性、氧化速率等生物物理性质,进而识别中药活性成分作用靶点。

中药活性成分的直接靶点筛选与验证技术有哪些?

【概要描述】随着化学蛋白组学技术的发展,越来越多的方法被建立并用于中药活性成分的靶点鉴定。简单来说,这些方法大致可被分为两类:1)标记法:通过化学改造,将中药活性成分改造成具有标记的探针,进而通过荧光成像或富集技术,对其靶蛋白进行鉴定。2)非标记法:不需要对中药成分进行修饰,基于中药活性成分和靶标蛋白结合后会影响靶标蛋白的热稳定性、氧化速率等生物物理性质,进而识别中药活性成分作用靶点。

  • 分类:华盈视角
  • 作者:高杰/王世东
  • 来源:
  • 发布时间:2023-07-14 13:48
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中医药蕴含着深厚的科学内涵,具有引领生命科学未来发展的巨大潜力。通过科技创新发掘中医药科学内涵,推动中医药的传承与创新,是实现中医药事业振兴发展的重大战略方向。中药药效物质和作用靶点不清晰是阻碍中药现代化与国际化的重要因素,用现代科学技术阐明中药活性成分的作用靶点和分子机制是中药研究的关键。随着化学蛋白组学技术的发展,越来越多的方法被建立并用于中药活性成分的靶点鉴定。简单来说,这些方法大致可被分为两类:1)标记法:通过化学改造,将中药活性成分改造成具有标记的探针,进而通过荧光成像或富集技术,对其靶蛋白进行鉴定。2)非标记法:不需要对中药成分进行修饰,基于中药活性成分和靶标蛋白结合后会影响靶标蛋白的热稳定性、氧化速率等生物物理性质,进而识别中药活性成分作用靶点。

I 基于标记法的靶点筛选

1、Pulldown:亲和垂钓技术该方法利用生物分子之间的亲和力原理,将小分子制成固相吸附剂并放置在层析柱中,将蛋白混合液倒入层析柱时,与吸附剂具有亲和力的蛋白质被吸附在层析柱中。随后选用合适的洗脱液,改变结合条件,将具有亲和力的蛋白质洗脱下来进行鉴定。亲和垂钓是最早提出、也是最经典的靶点发现方法,广泛应用于目标蛋白的鉴定。

2、ABPP:在2022年诺贝尔化学奖授予的点击化学基础上建立的活性蛋白质表达谱(Activity-based protein profiling)技术,是小分子药物靶点发现的重要技术。由于点击化学反应只需要在小分子药物上修饰分子量极小的炔基,相比其他技术,其更能保护小分子的活性。炔基化的小分子与叠氮基团发生环加反应,可将小分子连接到固相支持物上,从而可对生物体内的小分子蛋白靶点进行“钩钓”,进一步质谱分析即可发现小分子潜在靶蛋白。

3、人类蛋白质组芯片:HuProt™20K人类蛋白组芯片,芯片上有超过2万种人类全长蛋白质,覆盖81%的人类基因组ORF区,是目前世界上通量最高的蛋白质芯片。重组蛋白采用酵母表达系统,逐个进行表达与纯化鉴定。该芯片可确定直接结合蛋白,无需质谱鉴定,已经在多个研究领域得到应用,如蛋白质相互作用、小分子靶标研究等。

I 基于非标记法的靶点筛选

1 、 DARTS : DARTS ( Drug affinity responsive target stability)其原理为小分子配体与蛋白质结合后可增强该蛋白质的稳定性,避免其被蛋白酶降解。通过质谱检测SDS-PAGE中的保护带,实现靶蛋白的鉴定。该方法的优势在于进行目标识别时不需要对小分子进行任何的化学修饰,从而避免了繁琐的有机合成和因化合物空间结构改变带来的生物活性丢失。

 

 

2、CETSA:CETSA (Cellular thermal shift assay)由瑞典卡罗林斯卡学院的Dr.Martinez Molina于2013年首次提出,该方案的原理为小分子配体与靶蛋白质结合后可增加该蛋白质的热稳定性,导致该蛋白的溶解温度升高,即利用了配体化合物诱导的靶蛋白的热稳定现象。基于热稳定的原理,靶蛋白可耐受热变性而被保留在溶液中,随后采用免疫印迹法对其进行检测,CETSA与定量质谱结合可系统地研究药物与样本中靶蛋白的结合。

 

I 中药活性成分的直接靶点的验证

1、SPR(Surface plasmon resonance):SPR是一种基于光学、非标记的检测技术,可用于实时检测两个或更多分子间的结合作用。Biacore分子互作技术基于表面等离子体共振原理,可以实时、无标记、定量地表征分子间相互作用,已经为超过4万篇文献发表和上百种大小分子药物上市提供了可靠的数据支持,并被中、美、日三国药典收录,在基础科研、药物开发等多个领域得到了广泛应用。

2、BLI(Biolayer interferometry):BLI是基于光干涉原理的非标记技术,通过对光干涉信号的实时监测,BLI技术能够广泛应用于生物分子相互作用的分析和快速检测。生物分子A结合到光纤材质的生物传感器末端会形成一层生物膜,当传感器末端的分子A与待检测分子B结合时会引起传感器末端分子量的改变,从而导致生物膜厚度的改变。光通过传感器的生物膜层后发生透射和反射形成干涉光波,生物膜厚度的变化导致干涉光波发生相对位移。

3、MST(microscale thermophoresis):MST技术是一种基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率的变化而检测生物分子间结合、解离过程,获取分子间相互作用的模式和动力学常数等方面信息的新技术,是近年来发展的研究生物分子相互作用的强有力工具,是粒子在微观温度梯度中的定向运动。将其中一个互作分子标记荧光染料或者融合GFP标签,将标记蛋白和配体分子按照特定的浓度梯度置于毛细管中,红外激光加热产生一个微观的温度梯度场发生热泳动,其水化层、分子大小、电荷等分子性质会随着热泳动发生改变,进而引起反应体系中荧光分布的变化。

4、ITC(isothermal titration calorimetry):ITC通过直接检测生物分子结合过程中的释放或是吸收的热量,可准确的获得生物分子相互作用的完整热力学信息。当物质结合,热量要么产生,要么吸收。由于ITC直接测量生物分子结合事件中释放或吸收的热量,它便成为在单个实验中直接测定所有结合参数的唯一技术。这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。

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