神经母细胞瘤 (NB) 是一种源自胚胎发育过程中神经嵴的儿科癌症, 具有广泛的临床表现和结果。这种异质性反映在 5 年生存率的巨大差异上，低风险和中风险疾病从 90% 到 95% 到高风险疾病的 40% 到 50% 不等。了解人神经母细胞瘤 (NB) 的完整免疫细胞组成对于开发免疫疗法至关重要。

瑞典卡罗林斯卡学院、隆德大学、斯科讷大学医院和美国哈佛医学院的联合研究，对 19 个人神经母细胞瘤样本进行单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，结合Akoya空间单细胞蛋白组技术PhenoCycler(原CODEX超多重免疫荧光)、存活分析结果和正常胎儿肾上腺数据进行比较，提供了一个全面的免疫细胞景观，描述了从正常组织到神经母细胞瘤的细胞状态变化。

研究分析结果揭示了 27 种免疫细胞亚型，包括不同的骨髓、NK、B 和 T 细胞亚群。找到了几种细胞类型和提供生存率明显相关。与成人癌症和之前的 NB 研究相比，发现在对比正常组织和肿瘤组织时显示炎性单核细胞状态增加，而没有观察到 T 细胞的细胞毒性和耗竭评分以及 Treg 活性方面的差异。受体-配体相互作用分析揭示了一个高度复杂的 NB 微环境交互网络，其中几种受体-配体具有未来治疗研究的潜在价值。

作者收集了17 名 NB 患者（19 个样本）的肿瘤组织进行了单细胞转录组学，通过算法 CONOS33 对所有 NB 样本进行联合分析，并创建了一个免疫细胞图谱，揭示了主要免疫亚型的丰富库，包括骨髓、B、T 和 NK 细胞谱系，总共由 10 个簇组成。使用关键标记基因鉴定了这些免疫细胞簇：骨髓细胞（LYZ、C1QA、S100A9 和 CD1C）、B 细胞（MS4A1、BANK1 和 CD79A）、T 细胞（CD3D）、NK 细胞（CMC1 和 GNLY）。

NB样本中免疫细胞的种类和比例整体情况

同时，使用免疫组化验证scRNA-seq 数据中检测到的不同免疫细胞类型，观察其在的浸润和分布状态， T 细胞和巨噬细胞等免疫细胞浸润总体占肿瘤细胞总数的 5% 至 35%。结合免疫细胞在低、中和高风险组中的比例和生存分析，确定免疫相关基因的高表达与人类 NB 的生存率提高显著相关。

作者进一步研究了骨髓细胞浸润，将9个不同亚群分别标注为Mono-1/2、CLEC9A+ 髓样树突状细胞 (mDC)、CD1C+ mDC、成熟-LAMP3+ mDC 和 Macro-1、2、3 和 4，并确定其所属具体亚群类型。结果显示Mono-2 和 Macro-4 与生存率提高显著相关，而 Macro-1 与生存率降低显著相关。

评估NB样本中髓系细胞的种类、分布、和生存率的相关性

根据测序结果揭示10个不同的 T 细胞亚群，包括两个 CD4+ 细胞簇（Tregs [调节性 T 细胞] 和 Th17），4个细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) CD8+ 细胞簇 (CTL-1/4)，一个含有 CD4 细胞的幼稚 T 细胞簇表达和具有 CD8A/B 表达的细胞、增殖的 T 细胞簇和 NKT 细胞簇。通过Akoya空间单细胞蛋白组技术（PhenoCycler）超多重免疫荧光数据，显示了不同 T 细胞亚型的浸润情况。

评估NB样本中T细胞亚型、分布、在肿瘤区域中的浸润性、和生存率的相关性

为了研究位于 NB 微环境中的细胞之间的潜在相互作用和分子串扰，研究者进行了受体-配体相互作用分析，检测到基质和免疫细胞之间存在大量潜在的相互作用，包括 CTL1、间充质和内皮细胞群。其中semaphorin 6D (SEMA6D)/髓系细胞上表达的触发受体 2 (TREM2)、半乳凝素 9 (LGALS9)/甲型肝炎病毒细胞受体 2 (HAVCR2) 和分化24（CD24）/唾液酸结合Ig样凝集素10（SIGLEC10），都和NB生存率显著相关。

受体-配体相互作用分析

在这里，研究者创建了 NB 微环境中存在的免疫细胞的全面细胞和分子图谱，并为未来研究新疗法的开发提供了资源。作者结合了单细胞转录组学、Akoya空间单细胞蛋白组（PhenoCycler）超多重荧光免疫和计算机分析。细胞图谱显示了 27 种不同的免疫细胞亚型，它们在免疫群体内以及与 NB 中的肿瘤和基质细胞群体之间创建了一个高度独特的细胞和分子相互作用网络。

研究表明，NB 微环境中的免疫学景观出现并且很可能与充分表征的成人癌症肿瘤微环境不同。由于已知 NB 是在胚胎发育的早期开始的，肿瘤发育可能与免疫细胞发育同时发生，因此其他机制在 NB 微环境中发挥作用。详细描绘NB微环境，将为更好地理解免疫系统在 NB 中的作用铺平道路。未来的研究可进一步结合每种免疫细胞亚型的功能特性以及的不同细胞类型之间细胞-细胞相互作用。结合起来，这些生物学见解将有助于定制新的和改进的治疗方法，指导免疫系统对抗 NB。

PhenoCycler空间单细胞蛋白组学

华盈生物提供服务的Akoya的PhenoCycler（原CODEX）技术平台，采用专利的DNA偶联抗体检测技术结合自动化高分辨荧光显微镜，可还原蛋白质和特定细胞在组织中的真实分布。可实现近百种蛋白质的空间原位检测。

|   技术优势：

● 分辨率高，精确到0.251μm。

● 相比IMC，可实现全片扫描，无需预先限定感兴趣区域（ROI）。

● >70种已验证的DNA偶联抗体可供自由选择组合。

● 定制化更加灵活，可与商品化panel联合使用。

|   相关文献

1.The immune cell atlas of human neuroblastoma.

Volume 3, Issue 6, 100657, Jun 21, 2022. DOI:https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2022.100657

该文章转自：AkoyaBio微信公众号