2023年3月，该团队在ACS Cent Sci（IF=18.728）发表研究，发现金盏花活性成分蟛蜞菊内酯直接靶向sEH减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。

1、泽泻醇B改善AKI的作用及机制

研究首先通过腹腔注射顺铂造小鼠急性肾损伤模型，发现Alisol B能够以剂量依赖的方式显著增加小鼠体重、降低肾脏系数，且显著降低顺铂诱导的肌酐和尿素氮水平（图1A）。HE、PAS染色表明Alisol B能够改善顺铂诱导的肾组织损伤（图1B），表明Alisol B对顺铂诱导的AKI具有保护作用。进一步研究发现，Alisol B通过p53通路减弱顺铂诱导的肾细胞凋亡（图1C），通过NF-κB通路保护顺铂诱导的炎症（图1D），通过Nrf2通路缓解顺铂诱导的氧化应激和内质网应激（图1E）。

图1 泽泻醇B改善AKI的作用及机制

2、泽泻醇B改善AKI的直接靶点

为了鉴定Alisol B的直接靶点，研究采用Pulldown+MS方法在63kDa处的蛋白条带中鉴定到可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH，基因Ephx2）（图2A），已有报道称sEH的表达和活性与肾脏疾病有关，Ephx2基因缺失和sEH抑制均可减轻肾脏疾病。进一步采用Pulldown+WB（图2B）、DARTS（图2C）、CETSA（图2D）和SIP（图2E）验证发现Alisol B缓解了蛋白水解酶、温度和有机溶剂对sEH稳定性的影响，SPR发现Alisol B和sEH有较强的亲和力（图2F），分子对接（图2G）和突变实验（图2H）发现Alisol B通过与Gln384发生氢键相互作用与sEH结合。

图2 泽泻醇B改善AKI的直接靶点

3、泽泻醇B通过靶向sEH发挥作用

图3 泽泻醇B通过靶向sHE发挥作用

泽泻醇B作用机制模式图如下：

1、蟛蜞菊内酯改善ALI的作用及机制

研究首先通过体外实验发现WED在体外可通过NF-κB通路缓解体外炎症反应（图4A）以及Nrf2途径缓解体外氧化应激（图4B）。在体内可减轻LPS诱导的ALI小鼠的肺损伤（图4C），减轻炎症反应（图4D）和氧化压力（图4E）。

图4 蟛蜞菊内酯改善ALI的作用及机制

2、蟛蜞菊内酯改善ALI的直接靶点

为了鉴定WED的直接靶点，研究采用Pulldown+MS方法在63kDa处的蛋白条带中鉴定到可溶性环氧化物水解酶（sEH，基因Ephx2）（图5A）。进一步采用Pulldown+WB（图5B）、IP-MS（图5C）、DARTS和CETSA（图5D）、MST（图5E）和免疫荧光共定位分析（图5F）验证了WED与sEH的直接结合。进一步研究发现WED显著抑制人和小鼠的sEH活性，提高sEH底物14,15-EET水平并降低LPS诱导的巨噬细胞中其二醇水平，表明 WED 与 sEH 的直接结合作用。进一步分子动力学模拟发现WED与sEH氨基酸残基Phe36和Gln384的两个氢键相互作用（图5G）。将Phe362和Gln384分别突变为Phe362Ala和Gln384Ala后，Pulldown、CETSA、DARTS显示突变消除WE与sEH的结合（图5H）。在LPS刺激的RAW264.7细胞中，Phe362和Gln384突变也消除了WED的抗炎和抗氧化作用，表明氨基酸残基 Phe362和Gln384是WED与sEH结合的重要位点。

图5 蟛蜞菊内酯改善ALI的直接靶点

3、蟛蜞菊内酯通过靶向sHE发挥作用

已有研究表明抑制sEH会抑制GSK3β调控神经系统中NF-κB和Nrf2通路，研究人员发现sEH 敲低显著促进GSK3β的磷酸化，从而抑制GSK3β活性，WED对sEH的抑制可以降低 LPS暴露后巨噬细胞中的GSK3β活性，同时在sEH拯救后显著增加GSK3β活性（图6A），表明GSK3β是sEH在WED抗炎和抗氧化作用中的下游关键通路。最后体内实验发现sEH基因KO消除WED的肺保护作用（图6B），消除WED的抗炎和抗氧化作用（图6C），消除了WED对LPS暴露后巨噬细胞中的GSK3β活性的促进作用（图6D）。

图6 蟛蜞菊内酯通过靶向sHE发挥作用

天然产物是药物发现的宝贵资源，挖掘他们在不同疾病种的疗效并阐明其作用靶点和作用机制对扩大其临床适应症至关重要。两个案例作为经典的药靶研究文章，其思路如下：

1）发现中药活性单体对改善疾病。通过细胞实验、动物实验发现中药活性单体（泽泻醇B和蟛蜞菊内酯）改善疾病(AKI和ALI)表型，并且影响疾病相关的生物学过程，如炎症反应等；

2）筛选中药活性单体的作用靶点。通过Pulldown+MS方法揭示直接靶点sEH并进行筛选和验证；（达吉特可提供包括Pulldown+MS在内的其他筛选策略，如20K人类蛋白组芯片、ABPP、DARTS等）

3）研究靶点下游的表型相关通路。通过细胞实验、动物实验发现将靶点敲除以后药物不再发挥治疗作用，且疾病表型相关的信号通路如炎症通路发生改变。

达吉特专注于药靶研究，可为您寻找药物靶点提供多种多样的专业的技术服务和解决方案，助您解决药物靶点-机理研究中的各种难题。