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Nature子刊:蛋白芯片如何走进精子发育研究?

2016/05/06

 

   2016年4月11日,中国科学院生物物理研究所秦燕研究员课题组在国际权威学术期刊《Nature Structural & Molecular Biology》发表生殖医学最新研究成果(PMID: 27065197)。

 

   线粒体翻译延伸因子4(mtEF4)决定线粒体蛋白质翻译速率,并发现与小鼠雄性不育相关,但其机理尚不明确。研究人员采用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片(PEX100)对小鼠睾丸组织中的蛋白磷酸化谱进行了广筛,迅速锁定到mTOR信号通路的特异变化。通过进一步研究,发现mTOR通路在线粒体蛋白质翻译与细胞质蛋白质翻译之间发挥动态平衡调控作用,而mTOR通路的缺陷会引起精子细胞的细胞周期停滞和凋亡发生,进而诱发mtEF4敲除小鼠的不育现象。

 

   该研究发现了线粒体功能缺失在不育发病中的作用,并进行了详细机理解释,在生殖医学研究中的意义重大。而mTOR通路作用的发现,是本研究最为关键的一环,信号通路的蛋白磷酸化谱筛选工具为新的机制研究探索提供了很好的技术选择。本研究具体研究内容作如下赏析:

 

   翻译是在多种因子辅助下,核糖体结合mRNA模板,通过tRNA识别该mRNA的三联体密码子,转移相应氨基酸,进而按照mRNA信息依次连续合成蛋白质肽链的过程。最终产生的蛋白质是细胞和生物体生命活动的主要承担者、生物性状的体现者,控制人体内不同生物过程,使生命体得以运行

 

   在翻译过程中,线粒体延伸因子4(mtEF4)发挥着重要的催化功能,它是一种多肽链延伸过程的移位酶,使核糖体沿着mRNA倒退,从而调控蛋白质的合成 (Qin et al, Cell, 2006)。单对细菌和高等植物的mtEF4基因进行敲除并未获得明显的表型变化。本研究中,秦燕课题组的研究人员通过敲除哺乳动物小鼠的mtEF4基因,惊喜地发现mtEF4基因敲除阻滞了小鼠精子成熟过程,导致雄性小鼠不育表型的发生,见图1。 

 

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   图1. mtEF4敲除导致雄性小鼠不育

   

   a.雄性小鼠生育统计数据

 

   b.mtEF4影响精子浓度、形态、运动

 

   c.mtEF4敲除阻滞小鼠生精过程

 

   d.TUNEL分析细胞凋亡

 

   进一步研究发现,mtEF4基因的敲除导致线粒体形态异常,组成内膜系统的OXPHOS复合体也受到影响,结果见图 2


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   图 2. mtEF4的敲除导致线粒体异常

 

   

   a.mtEF4敲除导致内膜系统损伤

 

   b.BNG和IGA分析OXPHOS复合体含量和活性

 

   研究人员从mtDNA拷贝数、mRNA、翻译机制、蛋白合成、产物稳定五个层面进行线粒体表征测定。有意思的是,脉冲追踪实验结果显示:mtEF4敲除能促进线粒体翻译,增加心脏组织和睾丸组织mtDNA编码的13个多肽含量,但多肽稳定性却截然不同。心脏线粒体蛋白能稳定存在,但睾丸线粒体蛋白却被降解了,如图 3

 

   

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   图 3. mtEF4敲除影响线粒体翻译和蛋白稳定

 

   mtEF4敲除诱发小鼠不育背后的机制是什么呢?

 

   秦燕课题组与华盈生物合作,应用信号通路磷酸化广谱筛选抗体芯片PEX100(覆盖胞内31条经典信号通路),对WT和mtEF4-/-KO小鼠的睾丸组织中的蛋白磷酸化谱进行了系统筛选。经过PEX100芯片的梳理,研究人员迅速将研究目光聚焦在KO小鼠样本中磷酸化下调最显著的mTOR信号通路上。后续应用雷帕霉素处理KO小鼠,抑制其mTOR信号通路研究发现:小鼠出现心室变大,心脏衰竭等症状,心脏线粒体的OXPHOS复合体丰度也有所下降,见图 4

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   图 4. mTOR信号激活“补偿”线粒体翻译加速

 

   a.芯片结果中mTOR信号通路显著调变

 

   b.WB验证mTOR信号通路调变

 

   c.雷帕霉素抑制mTOR信号通路活性

 

   d.雷帕霉素处理引起心脏衰竭

 

   e.雷帕霉素处理降低心脏线粒体OXPHOS复合体丰度

 

   研究者推测可能是哺乳动物细胞的细胞质翻译系统和线粒体翻译系统通过彼此协调形成了一种新的进化适应机制,而mTOR信号通路在其中起了至关重要的作用。


   通过RT-sqPCR量化Atp5d mRNA(mTOR敏感性)的多核糖体分布,研究人员对细胞质翻译进行检测,结果证实:mtEF4敲除后,心脏组织中mTOR信号通路的上调引起ATP5D细胞质翻译加速,与之相反的是,睾丸组织中mTOR信号通路下调导致ATP5D细胞质翻译降低,该结果进一步验证了研究人员的推测,如图 5。

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图 5. 体细胞的细胞质翻译加速


   通过本研究,得到如下结论:mtEF4缺失时,体细胞激活mTOR信号通路加速细胞质翻译,平衡线粒体翻译加速引起的变化。而令人遗憾的是,mtEF4缺失反而显著下调生精细胞的mTOR信号通路活性,无法通过加速细胞质翻译来协调平衡线粒体翻译速率的升高,因此最终导致雄性小鼠不育。

 

   小结:

 

   研究成果最终揭示了线粒体翻译与细胞质翻译之间的协调机制:mtEF4敲除促进体细胞线粒体蛋白质翻译速率升高,激活mTOR信号通路,从而引起细胞质蛋白翻译速率增加,平衡了线粒体蛋白翻译增加引起的“负面影响”,这是一种全新的进化适应机制。与之相反的是,mtEF4敲除虽然也促进生精细胞线粒体蛋白翻译速率升高,但是下调了mTOR信号通路,无法引起细胞质蛋白翻译速率增加,导致线粒体蛋白质翻译增加引起“局面失衡”,精子成熟过程阻滞,最终诱发雄性小鼠不育,见图 6

 

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   图 6. 线粒体翻译与细胞质翻译之间的协调机制模式


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   英文链接:

 

   http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n5/full/nsmb.3206.html