文献赏析

如何选择一个好用的外泌体提取试剂盒?

2021/04/02

外泌体作为直径在30-150 nm的细胞外囊泡,广泛存在于血液、唾液、尿液等多种体液中。在生理和病理条件下,几乎所有类型的细胞都可以释放外泌体,这些外泌体通过运输关键核酸、蛋白质和脂质等进行细胞通讯和表观遗传调控,影响多种疾病的发生发展1。因此,对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析,同时也将用于疾病的治疗。目前,限制外泌体基础研究和应用研究的技术障碍主要包括如下两个方面:1)首先,如何简化提取步骤和提高外泌体的产量;2)如何有效区分外泌体与其他细胞外囊泡,特别是功能性微囊泡。

在过去的几十年中,尽管仍然没有标准化的外泌体分离方法,但是通过外泌体的理化特征已经建立了多种技术2,包括1)PEG(聚乙二醇);2)FC(超滤);3)SEC(尺寸排阻);4)dUC(差速离心);5)DG(密度梯度离心);6)AF4(切向流过滤);7)IP(免疫亲和)。其中dUC(差速离心法)是研究报道中更常见的分离策略,但是差速离心法也存在一些不足的地方,如:1)所需样本量大;2)外泌体得率低;3)需要昂贵的仪器设备——超速离心机;4)耗时长——全过程约需要4-9 h。为了解决以上问题,市场上出现了种类越来越多的外泌体提取试剂盒,它们依据外泌体的理化特征(大小、密度、表面maker等)实现外泌体的分离,且在基础科研中的应用越来越广泛。试剂盒在一定程度解决了UC提取的所需样本量大、得率低、设备难、耗时长的问题,但试剂盒的适用范围、质量好坏等参差不齐,针对特定的样本和特定的实验目的,以及自身的实验条件,选择更为合适的外泌体提取试剂盒对下游工作的开展至关重要。

近来上海交通大学医学院附属瑞金医院的科研人员开展了一项研究(PMID: 32716349),系统的比较多种商业化试剂盒与UC法提取血浆外泌体的差异,为科研工作者采用商业化试剂盒提取外泌体提供了一定的参考3。研究人员入组了9例癌症患者(其中正常对照、早期患者、转移患者各3例),将同组患者的血浆合并,总共得到3份血浆样本,每组的血浆样本分为6等分,分别采用5种商业试剂盒包括Wayen Exosome Isolation kit(WY,华盈生物)、ExoQuick(SBI)、miRCURY Exosome Kits(Qiagen)、Ribo Exosome Isolation Reagent(Ribo)、Total Exosome Isolation (Fisher)和UC(ultracentrifugation)分离外泌体。最后,对分离得到的外泌体进行转录组测序,比较各种分离方法在测序结果上的差异(图1)。

图1.各种外泌体提取试剂盒和超速离心方法的操作流程

首先,各种试剂盒在提取的外泌体粒径上并无明显差异,检测的外泌体粒径均在100 nm左右(图2A)。但相对其他试剂盒,Wayen Exosome Isolation kit在外泌体提取浓度上相对较高,1mL血浆样本含有更多的外泌体颗粒,而UC提取的外泌体浓度在所有方法中相对较低(图2B)。

图2. 各种方法分离的外泌体粒径和浓度的比较

随后,研究人员对提取的外泌体进行了RNA的建库,Wayen Exosome Isolation kit提取的外泌体RNA在200-1000bp片段范围内均得到更高的丰度(图3)。

图3.各种方法分离的外泌体evRNA文库长度分布的比较

接着,研究人员对比分析了各种试剂盒提取的血浆外泌体中各种类型RNA的比例,发现Wayen Exosome Isolation kit的表现和UC更为接近,所测得的short-noncoding RNA, pseudogene, long-noncoding RNA 及protein-coding genes比例基本相同,而其他试剂盒检测结果与UC存在较大差异(图4)。

图4. 不同方法分离的外泌体中各类RNA的比例

最后,关于各种方法提取的外泌体进行RNA的聚类分析,无论是Control组、primary组,还是metastatic组,同样是Wayen Exosome Isolation kit提取的外泌体RNA与UC组更为接近(图5)。

图5. 不同方法分离的外泌体中RNA聚类分析

总体来说,Wayen Exosome Isolation kit提取的血浆外泌体在用于转录组分析上,其表现与UC更为接近。

结合上述实验结果,以及UC和Wayen Exosome Isolation kit的分离特点,我们提出如下建议:

1) 当我们样本量较少的时候,UC得到的外泌体量较少,可以考虑采用Wayen Exosome Isolation kit方法;

2) 当我们样本量足够,想要得到更多外泌体或者浓缩外泌体用于下游实验的时候,可以考虑采用Wayen Exosome Isolation kit方法;

3) 当我们通过UC或者密度梯度离心获得的高纯度外泌体完成核酸或者蛋白组筛选后,进一步需要对个别分子进行验证实验的时候,采用Wayen Exosome Isolation kit方法提取外泌体更方便,也更容易标准化。

4) 针对外泌体核酸测序等实验,采用Wayen Exosome Isolation kit方法不仅能够接近UC的外泌体得率问题,而且能够获得与UC更为接近的核酸谱。

Wayen Exosome Isolation kit为华盈生物自主研发的Exosome Isolation Q3(简称EIQ3)系列外泌体提取剂盒,不仅有效提高外泌体得率,同时能够显著减少杂蛋白残留(如血清高丰度蛋白)。该试剂盒可以实现血清、血浆、尿液、细胞上清等液质样本中外泌体的快速提取,为后期外泌体研究的数据稳定性和可靠性提供保障。其主要特点在于:1)外泌体纯度高(Quality);2)外泌体得率高(Quantity);3)操作简便,周期短(Quick)(操作流程见图6)。

图6 EIQ3外泌体试剂盒使用方法

相关文献

[1] Raghu Kalluri, Valerie S., The biology, function, and biomedical applications of exosomes. [J]. Science. 2020 Feb 7;367(6478): eaau6977.

[2] Cocozza F, Grisard E, Martin-J Aular L, Mathieu M & C Théry., Snapshot: extracellular vesicles. [J]. Cell. 2020;182(1), 262-262.e1.

[3] Peng C, J Wang, Bao Q et al., Isolation of extracellular vesicle with different precipitation-based methods exerts a tremendous impact on the biomarker analysis for clinical plasma samples. [J]. Cancer biomarkers : section A of Disease markers. 2020;29(3):373-385.

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