文献赏析

高分文章策略二：血浆靶向检测组织来源的蛋白标志物

2020/11/16

血浆/血清蛋白标志物的检测已经应用在多种癌症及疾病的临床诊断中。在血浆/血清蛋白标志物筛选阶段，很多研究是通过蛋白质谱的方法直接鉴别疾病患者血浆/血清中的蛋白，通过和对照组别的比较，筛选出疾病患者特异性的血浆/血清蛋白作为标志物。但是这类研究会受到诸多因素的影响，例如样本的收集、处理和储存方式。另外一个重要的阻碍是血浆高丰度蛋白对质谱实验的干扰，其中有22个蛋白占据了血浆总蛋白量的99%。虽然某些高丰度蛋白也反映了一些有意义的生物学现象，但是这些蛋白的改变很可能是机体整体状态变化的结果，这些蛋白并不是直接来源于病原灶组织，而病原灶组织分泌到血浆中的蛋白含量很低。虽然目前几种去高丰度蛋白的方法已被普遍应用，但是利用质谱技术在血浆/血清中鉴定低丰度蛋白仍然是一个挑战。另外血浆蛋白容易受到外界因素影响，例如个体健康状态，生活方式和性别等的影响1。这些累计的因素造成了血浆蛋白组极其复杂的特征，阻碍了在血浆/血清中直接筛选反映疾病组织真实状态的标志物。为了解决这些问题，很多标志物研究的策略是在血浆中靶向检测疾病组织来源的蛋白标志物2。那么如何设计这样研究方案呢？今天华盈视角就和大家一起分享两个相关的精彩案例，和大家一起学习。



 

 

案例一  动脉粥样硬化组织蛋白组及血浆蛋白标志物的筛选

此项研究在研究思路、样本收集、数据分析和后续标志物的筛选阶段是非常值得大家学习借鉴的。特别是该研究的样本并不是从真正意义上临床病人获取，而是直接对无临床疾病诊断的尸检解剖组织进行病理分析，再开展蛋白组和标志物研究。虽然这种方式的样本收集并不容易，但是这种策略尤其对筛选疾病早期诊断标志物具有借鉴意义。此项研究2018年发表于心血管领域顶级期刊Circulation杂志（IF:23.603）3。

研究者首先对收集的100个尸检个体的左前降支冠状动脉（LAD）和腹主动脉（AA）组织分为了3个病理状态：正常（NL），脂肪纹（FS），纤维斑块（FP）。病理学结果展示了所有的纤维斑块几乎都是早期病变，同样死者生前也都没有被诊断为冠状动脉疾病。研究者对LAD和AA组织进行了label free蛋白质谱分析。质谱鉴定了LAD和AA组织中总共1925和1495个蛋白， 其中944个蛋白和725个蛋白分别可在50%的LAD和AA样本中被鉴别（图1A），这些缺失值少于50%的蛋白后续进行了WGCNA分析（图1B），发现了这些LAD和AA组织中的蛋白形成了相似的共表达模块，例如细胞呼吸相关的线粒体蛋白，染色体组装相关的核蛋白以及胞外基质蛋白，说明了动脉组织相关疾病的蛋白标志物很大部分来源于这些模块中富集的蛋白。

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图1 动脉粥样硬化组织蛋白组特征。

A.统计缺失值少于50%的蛋白，B. WGCNA分析

研究者接着利用多种回归性分析和convex analysis of mixtures（CAM）方法鉴别了分别与NL，FS，FP每种表型相关的特征性蛋白。PCA分析也表明这些特征性蛋白可以在LAD组织中区分这3种表型（图2A）。研究者分别比对了LAD和AA组织中FP和NL蛋白组的差异，在LAD和AA组织中分别鉴别了89个和166个差异性蛋白（FC≥ (+/–)1.7; q-value ≤0.05），研究者又通过IPA分析发现了LAD组织差异蛋白的功能与TNF-α通路的激活，以及和胰岛素通路，PPAR-α、PPAR-γ通路的抑制相关（图2B），但是AA组织差异蛋白的功能仅与TNF-α通路的激活有关，与其他通路并没有实质性的关联，说明了胰岛素通路，PPAR-α、PPAR-γ通路相关蛋白的变化或许可以用来鉴别动脉粥样硬化是否发生在LAD或者AA组织。

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图2 比较LAD组织中FP和NL的蛋白组

为了验证组织差异蛋白是否能够成为诊断动脉粥样硬化血浆标志物的来源？研究者在45个女性冠状动脉粥样硬化患者和41个对照女性患者血浆中对组织中38个和FP最显著相关的蛋白进行了MRM-MS分析。其中5个蛋白DRB1, LCP1, RNASE1, MTHFD1和CALU由于在血浆中没有可检测的多肽而剔除，然后研究者利用Skyline软件对剩余33个蛋白的86个多肽的323个碎片进行优化。在对MRM数据分析中，8个蛋白CATB, TSP1, NNMT, S100A9, ITIH2, POSTN, CORO1A和HTRA由于很低的信号比被排除，所以最终25个蛋白被定量作为潜在标志物（图3A）。ROC分析也表明了这些潜在标志物可以很准确的诊断冠状动脉疾病（AUC=0.93）（图3B）。这些结果再次验证了来源于疾病组织的蛋白可以在血浆中被检测，并且早期疾病组织表达的蛋白可以作为疾病诊断的标志物。
这个案例的亮点是通过正常组织筛选蛋白，然后分析和寻找冠状动脉相关的蛋白，最后在血浆中用进行检测。组织蛋白组不仅局限于揭示疾病发生机制，而且还可以作为血浆标志物的来源。这个案例为标志物的研究提供了强有力的证据，先通过组织蛋白组筛选疾病相关的蛋白，然后在病人血浆通过MRM检测。最重要的是这些组织蛋白可以在血浆中被高效的检测到（25/38），这个结果给标志物研究提供了新的启示。

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图3 血浆MRM验证组织来源的标志物


案例二   补体蛋白C5作为亚临床动脉粥样硬化的标志

本研究分为发现集和验证集两个阶段筛选和验证动脉粥样硬化早期的标志物。研究者总共纳入了799个受试者，发现集阶段此项研究和上述的案例采取相似的方法，收集了尸检的9个健康对照，7个脂肪纹（FS）患者和11个纤维斑块（FP）患者的腹主动脉组织中膜，另外又收集6个脂肪纹（FS）患者和12个纤维斑块（FP）患者的腹主动脉组织内膜开展标记定量TMT蛋白组学研究。在验证集阶段，研究者纳入了两个独立的人群，通过ELISA检测血浆中的待选标志物（图4）。此项研究在2020年发表于心血管领域的顶级期刊J Am Coll Cardiol（IF:20.589）4。

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图4.研究方案

TMT蛋白质谱在动脉中膜和内膜中总共鉴定了6500个蛋白，其中蛋白多肽大于1，在超过60%样本中可被鉴别的蛋白被定量分析，包括动脉中膜总共3079个蛋白，内膜3332个蛋白，其中有2660个蛋白是中膜和内膜共有的蛋白。和健康的动脉中膜相比，FS中膜含有340个差异蛋白，FL中膜含有328个差异蛋白。和FS内膜相比，FL内膜含有577个差异蛋白。功能富集分析发现了中膜和内膜中这些差异的蛋白都显著性富集到补体、脂转运和凝血通路，并且这些通路中蛋白的富集程度会随着疾病的进展而升高，在健康动脉中膜中含量最低，在FS中膜，FL中膜，FS内膜，FL内膜中蛋白丰度依次逐渐升高（图5A）。说明了这些通路蛋白在动脉粥样硬化的发生中发挥着关键作用。另外相关性分析显示了内膜中补体系统蛋白的丰度与其他的通路蛋白丰度间都呈现正相关（图5B），说明补体蛋白的改变可能是一个主导的因素。

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图5 动脉中膜和内膜蛋白组分析A. 从左到右：补体，脂转运，凝血，B.相关性分析

研究者接着更深入的分析了补体系统在FL内膜中的变化情况，结果发现了相比其他补体蛋白，“补体激活”相关的蛋白丰度在FL内膜中是最多的（图6A），其中最显著的是C3和C5蛋白（FL内膜 vs FS 内膜，FDR<0.05）（图6B）。研究者选取了C5作为候选标志物验证，首先通过western blotting和免疫组化验证了C5在FL内膜中表达最高（图6C），并且 ELISA也验证C5在FL内膜组织体外培养上清中的含量最高（图6D）。

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图6. 组织验证C5的表达

最后研究者采取利用ELISA方法检测了2个亚临床动脉粥样硬化人群血浆中C5的表达。每一个研究队列都通过影像学分析斑块的数量分为了2组：早期患者（0-2个）和泛发期患者（>2个）。ELISA检测结果表明了泛发期患者血浆中的C5含量显著高于早期患者。通过逻辑回归和多元线性回归分析也说明了C5可作为亚临床动脉粥样硬化独立的预测指标，与斑块负荷和冠状动脉钙化程度具有显著相关性（图7）。

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图7. 血浆C5蛋白可独立作为亚临床动脉粥样硬化的指标

 

小结

两个精彩的案例为大家勾画出了血浆靶向检测组织蛋白标志物的研究思路和技术路线，大家可以参考将组织样本和血浆或者其他体液样本联合起来研究，这样的标志物研究由于得到了病原组织的证据支持，是更容易被Top期刊接收的。另外，组织蛋白组的筛选还可以为进一步的机制研究提供丰富的数据支撑，可谓是一举两得。好的思路值得华盈视角的解读和推荐，大家可以赶快行动起来了！

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相关文献

1. Nedelkov D, Kiernan UA, Niederkofler EE et al., Investigating diversity in human plasma proteins. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(31):10852-10857.  

2. Zhang H and Chan DW. Cancer biomarker discovery in plasma using a tissue-targeted proteomic approach. [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007;16(10):1915-1917. 

3. Herrington DM, Mao C, Parker SJ et al., Proteomic Architecture of Human Coronary and Aortic Atherosclerosis. [J]. Circulation. 2018;137(25):2741-2756. 

4. Martínez-López D, Roldan-Montero R, García-Marqués F et al., Complement C5 Protein as a Marker of Subclinical Atherosclerosis. [J]. J Am Coll Cardiol. 2020;75(16):1926-1941.

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