血浆/血清蛋白标志物的检测已经应用在多种癌症及疾病的临床诊断中。在血浆/血清蛋白标志物筛选阶段,很多研究是通过蛋白质谱的方法直接鉴别疾病患者血浆/血清中的蛋白,通过和对照组别的比较,筛选出疾病患者特异性的血浆/血清蛋白作为标志物。但是这类研究会受到诸多因素的影响,例如样本的收集、处理和储存方式。另外一个重要的阻碍是血浆高丰度蛋白对质谱实验的干扰,其中有22个蛋白占据了血浆总蛋白量的99%。虽然某些高丰度蛋白也反映了一些有意义的生物学现象,但是这些蛋白的改变很可能是机体整体状态变化的结果,这些蛋白并不是直接来源于病原灶组织,而病原灶组织分泌到血浆中的蛋白含量很低。虽然目前几种去高丰度蛋白的方法已被普遍应用,但是利用质谱技术在血浆/血清中鉴定低丰度蛋白仍然是一个挑战。另外血浆蛋白容易受到外界因素影响,例如个体健康状态,生活方式和性别等的影响1。这些累计的因素造成了血浆蛋白组极其复杂的特征,阻碍了在血浆/血清中直接筛选反映疾病组织真实状态的标志物。为了解决这些问题,很多标志物研究的策略是在血浆中靶向检测疾病组织来源的蛋白标志物2。那么如何设计这样研究方案呢?今天华盈视角就和大家一起分享两个相关的精彩案例,和大家一起学习。
案例一 动脉粥样硬化组织蛋白组及血浆蛋白标志物的筛选
此项研究在研究思路、样本收集、数据分析和后续标志物的筛选阶段是非常值得大家学习借鉴的。特别是该研究的样本并不是从真正意义上临床病人获取,而是直接对无临床疾病诊断的尸检解剖组织进行病理分析,再开展蛋白组和标志物研究。虽然这种方式的样本收集并不容易,但是这种策略尤其对筛选疾病早期诊断标志物具有借鉴意义。此项研究2018年发表于心血管领域顶级期刊Circulation杂志(IF:23.603)3。
研究者首先对收集的100个尸检个体的左前降支冠状动脉(LAD)和腹主动脉(AA)组织分为了3个病理状态:正常(NL),脂肪纹(FS),纤维斑块(FP)。病理学结果展示了所有的纤维斑块几乎都是早期病变,同样死者生前也都没有被诊断为冠状动脉疾病。研究者对LAD和AA组织进行了label free蛋白质谱分析。质谱鉴定了LAD和AA组织中总共1925和1495个蛋白, 其中944个蛋白和725个蛋白分别可在50%的LAD和AA样本中被鉴别(图1A),这些缺失值少于50%的蛋白后续进行了WGCNA分析(图1B),发现了这些LAD和AA组织中的蛋白形成了相似的共表达模块,例如细胞呼吸相关的线粒体蛋白,染色体组装相关的核蛋白以及胞外基质蛋白,说明了动脉组织相关疾病的蛋白标志物很大部分来源于这些模块中富集的蛋白。
图1 动脉粥样硬化组织蛋白组特征。
A.统计缺失值少于50%的蛋白,B. WGCNA分析
图2 比较LAD组织中FP和NL的蛋白组
图3 血浆MRM验证组织来源的标志物
案例二 补体蛋白C5作为亚临床动脉粥样硬化的标志
本研究分为发现集和验证集两个阶段筛选和验证动脉粥样硬化早期的标志物。研究者总共纳入了799个受试者,发现集阶段此项研究和上述的案例采取相似的方法,收集了尸检的9个健康对照,7个脂肪纹(FS)患者和11个纤维斑块(FP)患者的腹主动脉组织中膜,另外又收集6个脂肪纹(FS)患者和12个纤维斑块(FP)患者的腹主动脉组织内膜开展标记定量TMT蛋白组学研究。在验证集阶段,研究者纳入了两个独立的人群,通过ELISA检测血浆中的待选标志物(图4)。此项研究在2020年发表于心血管领域的顶级期刊J Am Coll Cardiol(IF:20.589)4。
图4.研究方案
图5 动脉中膜和内膜蛋白组分析A. 从左到右:补体,脂转运,凝血,B.相关性分析
图6. 组织验证C5的表达
图7. 血浆C5蛋白可独立作为亚临床动脉粥样硬化的指标
小结
相关文献
1. Nedelkov D, Kiernan UA, Niederkofler EE et al., Investigating diversity in human plasma proteins. [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(31):10852-10857.
2. Zhang H and Chan DW. Cancer biomarker discovery in plasma using a tissue-targeted proteomic approach. [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007;16(10):1915-1917.
3. Herrington DM, Mao C, Parker SJ et al., Proteomic Architecture of Human Coronary and Aortic Atherosclerosis. [J]. Circulation. 2018;137(25):2741-2756.
4. Martínez-López D, Roldan-Montero R, García-Marqués F et al., Complement C5 Protein as a Marker of Subclinical Atherosclerosis. [J]. J Am Coll Cardiol. 2020;75(16):1926-1941.
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