文献赏析

华盈视角:外泌体蛋白组如何帮助小样本量 标志物研究发到高分杂志?

2020/08/10

高分杂志中的标志物研究一般具有大样本量、队列动态随访监测、多中心验证及标志物新颖性等几个特点。然而,并不是所有标志物研究项目都能够具备这样庞大的资源。

那么,如何在小样本量的基础上,发表高分标志物研究的文章呢?外泌体首先解决了标志物新颖性的问题,但其它方面的要求就需要通过巧妙的实验设计和标志物下游的机制研究来作为补充了。今天华盈视角将通过两个精彩的案例,为大家梳理出一条精炼的小样本量标志物研究高分文章的思路来。




 

 

案例一 外泌体在慢性淋巴白血病进展中的标志物及功能研究

血液中恶性B细胞增多会促进慢性淋巴白血病(CLL)的进展。这些恶性B细胞的存活依赖于周围微环境中的信号调控,其中血浆外泌体就是其中一个调控因素,因此前期研究者对CLL中的外泌体microRNA和蛋白质组也进行了相关分析。但是在CLL不同进展阶段外泌体蛋白质组的差异,以及外泌体在CLL进展中的功能机制前期并没有研究清楚。为了解决上述问题,本案例的研究者对不同阶段CLL病人血浆外泌体开展了基于蛋白组学的标志物研究。此项研究2017年发表于Blood杂志(17.543)。

1

筛选外泌体蛋白标志物


为了筛选比较CLL不同阶段的外泌体标志物,本案例总共纳入了34个CLL患者,首先根据病情程度分为了慢性期(16个病人)和进展期(18个病人)2个组别;然后为了追踪鉴别每一个病人的CLL进展,对每一个病人采取2个时间段收集血浆提取外泌体。对于慢性期病人,2个时间段分别是:诊断阶段和随访4年后的阶段,并且依然属于慢性期;对于进展期病人,2个时间段分别是:进展性诊断阶段和进展晚期(图1)

 

图片2.png

1.外泌体标志物研究分组

研究者首先对分离的血浆外泌体进行电镜,NTAWestern bloting验证分析(图2a-c,之后通过LC-MS/MS蛋白质谱技术对外泌体开展蛋白质组学分析。外泌体标志物发现阶段,研究者对5个慢性期病人和5个进展性病人分别按照以上2个时间段收集病人的血浆外泌体开展蛋白质谱研究,利用FunRich软件对质谱结果进行蛋白-蛋白互作分析,发现在进展性晚期病人外泌体中特异性高度富集炎症,氧化应激,细胞生长和凋亡,肿瘤增殖以及淋巴细胞侵袭相关通路的蛋白(图2d,箭头指示)。说明外泌体中的这些通路蛋白高度表达与CLL的进展有关。为了进一步揭示外泌体中与CLL的进展相关的关键蛋白,研究者利用PatternLab软件以及更严谨的准则筛选在进展性晚期特异性表达的外泌体蛋白,最后发现了10个这种特异性蛋白,其中JUP和S100-A9的差异最显著(图2e), 之后Western bloting也验证了JUP和S100-A9高表达在5个进展性病人晚期血浆外泌体而不是前期,同样在5个慢性期病人诊断阶段和4年后的血浆外泌体都没有表达(图2e)。因为S100-A9参与炎症反应,是调控肿瘤生长和转移的关键因子,研究者将S100-A9作为待选标志物验证。

标志物验证阶段中,收集5个健康者的血浆外泌体,以及对11个慢性期病人和13个进展性病人分别按照以上2个时间段收集血浆外泌体,利用Western bloting检测S100-A9表达。结果和发现阶段一致,在健康者和慢性期病人的2个阶段外泌体都有很低的S100-A9表达或者不表达,对于进展期病人,晚期病人血浆外泌体中的S100-A9表达量要显著高于早期病人(图2f,g)。这些结果说明CLL病人血浆外泌体高度表达S100-A9与疾病进展有关。

 

图片1.png

图2. 外泌体蛋白质组筛选差异蛋白
一个外泌体标志物的前期筛选就完成了,如果没有再多的临床样本量进行标志物的验证研究,发表在这种级别期刊上那就要基于以上蛋白组学的分析来开展CLL中外泌体的功能机制研究了。

2

外泌体标志物功能研究-确定供体细胞


外泌体功能机制研究首先要确定外泌体的供体和受体细胞。研究者发现体外培养的进展性病人的B细胞上清外泌体中高表达S100-A9,说明晚期病人血浆中S100-A9表达的外泌体至少部分来源于恶性B细胞(图3a)。流式细胞结果也验证了晚期进展性病人血浆中有更多的S100-A9阳性B细胞(图3b,c)。因为S100-A9可以激活NFκB信号通路,所以研究者检测了晚期病人中恶性B细胞中NFκB信号是否也被激活。研究者发现了S100-A9的受体EMMPRIN在CLL病人B细胞中的表达要高于健康对照(图3d),体外实验也验证了S100-A9可以与B细胞表达的EMMPRIN结合(图3e)。最后研究者也发现在晚期进展性CLL病人B细胞中高表达磷酸化的IKBA(图3f),并且核内p65蛋白的表达显著增加(图3g),CLL病人中S100-A9的表达量和磷酸化的IKBA表达量呈现正相关(图3h)。这些结果说明在晚期CLL病人恶性B细胞中S100-A9/EMMPRIN/NFκB这条信号通路被激活。

 

图片3.png

图3.确定S100-A9表达的外泌体来源

3

外泌体标志物功能研究-确定受体细胞


那么外泌体作用的受体细胞是什么?研究者推测在疾病进展中,恶性B细胞增多可能是由于非活性的B细胞转变成了恶性B细胞:恶性B细胞分泌的外泌体携带S100-A9,与非活性B细胞表面的受体结合,激活下游的NFκB信号通路从而活化B细胞。为了验证这个假设,研究者分离非进展性CLL病人B细胞体外培养,然后分别加入早期进展性病人血浆S100-A9阴性的外泌体和晚期进展性病人血浆S100-A9阳性的外泌体孵育。结果发现表达S100-A9的外泌体会显著增加非进展性病人B细胞中磷酸化IKBA和核内p65的表达量(图4a-c)。利用S100-A9抗体预先中和外泌体S100-A9会显著减弱外泌体对NFκB信号通路的激活效应(图4d)。这些结果说明晚期CLL病人血浆中外泌体高表达S100-A9,并通过S100-A9/EMMPRIN/NFκB信号通路激活B细胞恶化。

 

图片4.png

图4. 确定外泌体的受体细胞及作用机制

案例二 外泌体在囊性纤维化疾病进展中的标志物及功能研究


囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)是由CFTR基因突变导致的进行性遗传病。随着年龄增加并发症的风险也会提高。CF会造成持续性的呼吸道感染,最终导致呼吸衰竭。已有研究表明在CF病人中过量的中性粒细胞征募到肺部会诱导炎症性肺部损伤。但是CFTR活性减少是怎样造成这些炎症反应的并不清楚。本案例的研究者认为外泌体在肺部炎症中可能执行重要作用。所以研究者利用CF肺表皮细胞系(CFTR基因突变)和不同年龄阶段CF病人支气管肺泡灌洗液(BALF)开展了外泌体的研究。相关成果2020年发表于Thorax杂志(8.834)。

1

外泌体NTA计数作为标志物


 

 

为了验证外泌体数量可以作为CF标志物,研究者对外泌体进行NTA计数(图4),分别对比肺表皮细胞系上清外泌体和和病人BALF外泌体数量差异(图4)。研究者首先通过超速离心方法分离的细胞上清和BALF中的外泌体进行电镜,NTA和Western bloting验证分析(图5a-c)。研究者比较了2种CF肺表皮细胞系(CFBE41,CuFi-5)和2种正常肺表皮细胞系(HBE41,NuLi-1)上清外泌体颗粒数,结果发现2种CF肺表皮细胞系会分泌更多的外泌体(图5d-e)。基于以上细胞结果,研究者在临床样本上去验证BALF中的外泌体数量是否可以区分鉴别不同阶段的CF。因为CF病人年龄越高,并发症的风险就越大,研究者将12个CF病人分为4个年龄组:group1, 1-2;group2, 5-6岁;group3, 8-11岁;group4, 大于18岁;每组3个病人(图4)。首先每组和年龄匹配的正常人相比,除了1-2岁CF病人,其余3组CF病人BALF含有更多的外泌体(图5f)。另外在CF病人组间比较,结果发现随着年龄增加,CF病人BALF中的外泌体逐渐增加(图5g)。这些结果说明BALF中的外泌体数量与CF的进展具有相关性

图片5.png

 

4. 外泌体计数标志物分组

为了证实CF中外泌体数量变化与CF的直接相关性,是不是直接由于CFTR活性改变而导致的,研究者首先利用治疗CF的药物鲁玛卡托(lumacaftor),特扎卡托(tezacaftor )和伊伐卡托(ivacaftor )处理2种CF肺表皮细胞系(CFBE41,CuFi-5)来恢复CFTR的表达(图6a-b,左),结果表明药物处理后的CF肺表皮细胞系(CFBE41,CuFi-5)上清中的外泌体数量会显著减少(图6a-b,右)。这说明CFTR活性降低直接导致了细胞分泌的外泌体数量增多。然后研究者比对了4个CF病人处理伊伐卡托前后BALF中外泌体数量,结果发现处理后的CF病人BALF中外泌体数量减少(图6c),但是没有显著性。可能因为样本数量太少所以要想对CF病人BALF中外泌体数量作为标志物研究,还需要大量样本的独立验证所以在这些小样本研究的前期基础上,要发高分文章还是要研究外泌体的功能机制。

图片6.png

5. 外泌体NTA计数

 



图片7.png

6. CFTR活性降低直接导致了细胞分泌的外泌体数量增多

2

外泌体蛋白质组研究


 

 

 

虽然研究者想要研究CF中外泌体和炎症间的关系,但是从哪里入手?研究者果断采取了蛋白质谱技术对外泌体进行蛋白组学研究,分析CF外泌体中有哪些蛋白质,然后推测验证外泌体在CF中的作用。研究者利用label free蛋白质谱技术分析了CF肺表皮细胞系CFBE41和正常肺表皮细胞系HBE41上清外泌体中的蛋白质(图7a),IPA分析发现CFBE41外泌体中的差异蛋白很多富集到免疫相关通路和整合素信号通路上。对CFBE41外泌体中上调最显著的10个蛋白分析,发现它们与中性粒细胞脱粒,补体和整合素相关(图7b),Western bloting也验证了3个显著的蛋白VCAM, EPCAM, S100-A12在2种CF肺表皮细胞系(CFBE41,CuFi-5)上清外泌体中的都显著性上调,和质谱结果一致(图7c),其中最显著的是S100-A12蛋白(图7b,c,红色箭头)。然后研究者对总共20个不同年龄段CF病人BALF中的外泌体和10个正常人BALF中的外泌体进行蛋白质谱分析(图7d)。结果发现CF病人BALF中的外泌体蛋白很高的富集在中性粒细胞脱粒,补体等通路上(图7e)。然后研究者比对了CF疾病进展中各个年龄段BALF中外泌体蛋白的差异,研究者将1-2岁CF(group1)病人组分别和5-6岁组(group2),8-11岁组(group3),大于18岁组(group4)相比,分别有45,116和42个显著差异蛋白。并且group3和group4中S100-A12都显著上调(图7f,红色箭头),这个结果和细胞上清外泌体质谱结果一致,说明外泌体高表达S100-A12可能与CF的进展相关。

图片8.png

图7. 外泌体蛋白质组学

3

外泌体功能研究


 


蛋白组学已经揭示了CF中外泌体富含和中性粒细胞相关的蛋白,所以研究者聚焦在外泌体和中性粒细胞间的关系上。研究者验证了从健康者和CF病人全血分离的中性粒细胞都可以摄取标记的CFBE41上清外泌体(图8a)。和HBE41上清外泌体相比, CFBE41上清外泌体可以显著增加健康者中性粒细胞活性和迁移率(图8b)。CF病人(13-17岁)的中性粒细胞经CFBE41上清外泌体处理后,迁移率会显著高于健康者和低年龄段CF病人(2-4岁)(图8c)。这些结果说明CF肺表皮细胞来源的外泌体可以促进中性粒细胞迁移和提高其活性,随着疾病进展这种效果会更加明显。那么外泌体调控中性粒细胞的机制是什么?来自于质谱结果提供了重要线索,因为S100-A12高表达在CF外泌体中,研究者推测外泌体的功能依靠S100-A12介导的信号通路实现的。研究者发现CFBE41上清外泌体处理的中性粒细胞会显著增加S100-A12的受体RAGE和下游效应蛋白磷酸化p38,磷酸化p44的表达(图8d),CFBE41细胞中沉默S100-A12后,上清外泌体对中性粒细胞的作用效应会显著下降(图8f)。这些结果说明CF中肺表皮细胞分泌的外泌体对中性粒细胞的作用效能依赖于S100-A12/RAGE信号通路。

图片9.png

图8. CF外泌体的功能分析

小结

 

 


这两篇文章都是先用小样本量开展外泌体标志物的研究,然后,在筛选到外泌体计数差异或者蛋白差异后,并没有进行传统标志物的大样本验证。而是通过基于外泌体蛋白质组学的方法开展了功能研究。两个研究都按照相似的方案去揭示外泌体的作用机制:首先确定外泌体的供体细胞和受体细胞,然后根据蛋白组筛选的差异蛋白分析作用机制,最后验证信号通路是外泌体发挥作用的机制。由此可见外泌体蛋白质功能机制的研究并不是很难,只要找准了关键蛋白,之后进行蛋白互作分析信号通路分析验证机制。华盈视角依据两个案例的研究思路为大家总结了如下技术路线,供大家参考:

图片10.png

华盈生物在外泌体领域,经过多年的深耕与发展,逐渐形成了一套完整的科研服务体系,服务涵盖:提取、鉴定、分析及试剂耗材等领域。经过多年发展,华盈生物的外泌体业务在国内享有较高的声誉。但我们不止于此,近两年我们积极与国际知名外泌体研发企业合作,引入不同的仪器、试剂、耗材,为广大科研工作者的研究更添一臂之力。

微信图片_20200806112650.jpg

业务咨询:400-869-2936

相关文献

 

 

 

1. Daniel Prieto, Natalia Sotelo, Noé Seija et al., S100-A9 protein in exosomes from chronic lymphocytic leukemia cells promotes NF-κB activity during disease progression.[J].Blood.2017,130(6):777-788. 

2. Zivile Useckaite, Mark P Ward, Anne Trappe et al., Increased extracellular vesicles mediate inflammatory signalling in cystic fibrosis.[J]. Thorax.2020;75(6):449-458.

相关阅读

 

 


1. 华盈视角:外泌体蛋白质组分析如何助力肿瘤微环境研究

2. 外泌体蛋白质组学服务

3. 外泌体研究:临床医生申请国自然的小窍门

4. 国自然申请专题:外泌体研究经典技术路线(一)