华盈视角：“断肠草”雷公藤的新靶点发现之路

2020/06/01

雷公藤又名“断肠草”，是中医药宝库中著名的“以毒攻毒”的神秘药物，与砒霜齐名。2007年，雷公藤红素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素和姜黄素被《Cell》杂志列为最有可能也最值得开发为现代药物的五种天然化合物。雷公藤红素（celastrol）是雷公藤的主要活性成分，被广泛用于各种炎症、免疫紊乱及心血管疾病的治疗中。

低剂量的雷公藤红素被发现具有保护心血管的作用，是高血压性心脏病的“护心丸”，但其潜在药物机理并不明确。2020年4月，温州医科大学药学院梁广教授与温州医科大学附属第一医院心内科黄伟剑教授课题组，联合攻关，综合运用Huprot 20K人类蛋白质组芯片、表面等离子共振（SPR）、计算机模拟分子对接技术等为雷公藤红素找到了新的分子靶点，确定雷公藤红素通过与STAT3直接结合，抑制血管紧张素(AngⅡ)诱导的心功能障碍的明确药物机理。相关研究成果于2020年4月发表于顶级心血管研究杂志《Circulation Research》（IF=15.9）上。本文应用的实验技术路线可以为广大小分子药物研究工作者提供思路借鉴。

表型确认

雷公藤红素抑制AngⅡ诱导的心肌细胞异常

为了确定雷公藤红素在心肌细胞异常中的作用，作者用1 mol/L AngⅡ处理大鼠原代心肌细胞和H9C2细胞6h。结果发现AngⅡ处理显著增加了原代心肌细胞和H9C2细胞中β-MyHC（肥大标志物）、TGF-β1（纤维化标志物）和胶原蛋白I（COL I）mRNA的表达水平，说明造模成功。而雷公藤红素施用后可呈剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的基因表达（图1A、B）。进一步，研究人员对原代心肌细胞和H9C2细胞进行了罗丹明蛋白染色，结果显示：雷公藤红素降低了AngⅡ诱导的心肌细胞大小增加（图1C）。上述结果表明，雷公藤红素可以缓解AngⅡ诱导的心肌细胞异常现象。

图1 雷公藤红素可以缓解Ang II诱导的心肌细胞异常

靶点筛选

20K蛋白质组芯片筛选雷公藤红素结合靶蛋白

为了探索雷公藤红素缓解AngⅡ诱导的心肌细胞异常的潜在机理，该研究运用Huprot 20K人类蛋白质组芯片（覆盖2万多种人类全长蛋白）技术对雷公藤红素的靶蛋白进行了广泛筛选。将雷公藤红素通过羟基羧合的方式标记上生物素Biotin（图2A），将生物素化的雷公藤红素与Huprot 20K人类蛋白质组芯片进行孵育，利用Cy3-SA-Biotin标记体系进行示踪，识别雷公藤红素直接结合的靶蛋白（图2B）。芯片筛选结果显示，雷公藤红素具有明显的多靶点调控特点，可以和大批量蛋白质结合（图2C）。通过蛋白相互作用（PPI）结合蛋白家族（Protein Family）富集分析发现，雷公藤红素与Prdx（过氧化物还原酶）家族、Vps27-Hrs-STAM结构域蛋白和STAT家族蛋白结合富集性最高（图2D）。这一结果也得到了转录组数据的证实。

然而，将H9C2细胞中Prdx1/2敲减后并没有改善AngⅡ引起的心肌细胞基质蛋白表达和细胞肥大现象。而目前也没有报道表明Vps27-Hrs-STAM结构域蛋白与心肌细胞变化和AngⅡ有关。因此，研究人员将目标聚焦在富集分析排在第三位的STAT蛋白家族上（图2D）。

前人研究发现，STAT3在保护心肌细胞异常激活及心肌肥大方面发挥着重要作用。20K蛋白质组芯片也显示雷公藤红素与STAT3的结合的信噪比（SNR）达到3.95，十分显著（图2E），这表明STAT3很可能是雷公藤红素治疗心脏病的主要靶点蛋白。

图2 雷公藤红素结合靶蛋白筛选实验

靶点验证

SPR与分子对接确认雷公藤红素靶蛋白STAT3

研究人员首先通过表面等离子共振技术（SPR），体外验证了雷公藤红素可以与rhSTAT3（重组人STAT3）直接结合，解离平衡常数KD（M）为15.73 μmol/L（图3A），说明二者具有较强的结合力。为了进一步验证两者的结合作用，研究人员通过竞争ELISA实验证实了生物素标记的雷公藤红素与rhSTAT3的结合现象可以被高浓度的非标记雷公藤红素竞争性抑制，再次证实了雷公藤红素可以与rhSTAT3直接结合（图3B）。

同时，通过pull-down实验，研究人员证实了雷公藤红素与STAT3蛋白在H9C2细胞（图3C）和心肌组织中也直接结合（图3D）。并且在原代心肌细胞中证实雷公藤红素与STAT3上游的蛋白IL-1R、JAK不能结合（图3E）。

图3 雷公藤红素结合靶蛋白验证

分子对接

筛选和验证雷公藤红素结合的靶蛋白位点

为了进一步明确雷公藤红素与STAT3的结合位点，研究人员应用计算机模拟分子对接技术，在CCD和SH2两个STAT3经典domain中对100个氨基酸残基位点进行分子对接模拟，确定了CC domain中的Leu-207残基和SH2 domain中的Gln-635和Val-637残基与雷公藤红素具有最小的结合能（图4A、C），显示该3个氨基酸残基组成的对接位相结构（dock）是雷公藤红素结合和调控STAT3的关键区域（图4B、D）。进一步，研究人员通过氨基酸突变的方式，证实了分子对接模拟的结果，即雷公藤红素确实结合在STAT3的Leu-207、Gln-635和Val-637残基构成的dock中（图4E）。

图4 雷公藤红素与STAT3结合位点确认

机理发现

雷公藤红素抑制STAT3核转移治疗心肌肥大

为进一步确定雷公藤红素如何通过抑制STAT3治疗心肌肥大的具体机理，研究人员首先构建了STAT3沉默和STAT3过表达的质粒转入原代心肌细胞中，并对其进行AngⅡ和雷公藤红素处理。结果显示，AngⅡ诱导的β-MyHC（肥大标志物）和TGF-β1（纤维化标志物）高表达，在施用雷公藤红素和沉默STAT3后，这些心肌肥大标志物的表达均受到显著抑制（图5A）。同时，在施用雷公藤红素后，STAT3的磷酸化水平也受到了一定程度的抑制（图5B）。

研究人员进一步利用Ang II微泵和主动脉缩减术诱导小鼠心肌细胞异常，将STAT3抑制剂S3I-201 (S3I)和雷公藤红素分别适用于模型小鼠，心脏组织H&E染色结果显示雷公藤红素和S3I均能减弱Ang II引起的的组织病变和心肌细胞肥大(图5C)。

图5 雷公藤红素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纤维化

为了进一步了解雷公藤红素是如何影响STAT3而对AngII诱导的心肌细胞异常产生作用的。作者选用Tyr-705位点磷酸化的STAT3蛋白（p-STAT3）作为STAT3激活的标志。研究发现雷公藤红素预处理可以抑制Ang II诱导的原代心肌细胞STAT3 Tyr-705位点磷酸化。由于计算机模拟分子对接中雷公藤红素与STAT3结合的关键氨基酸残基是导致STAT3蛋白发生核移位的关键区域。因此，研究人员通过检测STAT3蛋白在胞核和胞质组分中的表达，发现雷公藤红素可以减少AngII介导的STAT3在原代心肌细胞中向细胞核内的移位(图6A、B)。

前人研究表明，KPNA3蛋白是STAT3核转移的载体蛋白，于是，研究人员在心肌细胞中利用免疫共沉淀技术证实了STAT3与KPNA3确实存在结合，而雷公藤红素可以抑制STAT3-KPNA3复合物的形成（图6C）。由于STAT3入核后会介导一系列与心肌肥大和纤维化相关的基因转录，研究人员利用染色体免疫共沉淀（CHIP）结合RT-PCR技术证实了在初始心肌细胞中STAT3确实可以与myh7、 Col1a和 Tgfb1等基因结合（图6D）。

图6雷公藤红素抑制STAT3入核调控心肌肥大基因表达

综合上述研究，研究人员通过人类蛋白组芯片技术、表面等离子共振技术及计算机模拟分子对接技术（华盈生物均可提供全套服务）发现了雷公藤红素结合的新靶点STAT3，并通过一系列体外/体内功能实验和Rescue实验，最终明确雷公藤红素是通过结合STAT3的第207位氨基酸，进而抑制了Ang II诱导的STAT3入核发挥转录因子作用（即STAT3与myh7、 Col1a和 Tgfb1等基因结合，介导这些心肌肥厚和纤维化相关基因的表达），来达到治疗和预防高血压性心脏病的药物机理（图7）。