文献赏析

华盈视角:中医肿瘤研究所陈文连/贾立军团队发现果糖代谢转运蛋白GLUT5促进肺癌恶性生长“双重机制”

2020/02/19


肺癌(LC)是一种高度致命的恶性肿瘤,它的快速生长需要主要代谢燃料的过度分解代谢。然而,LC细胞为了保持葡萄糖代谢活性而大量消耗葡萄糖,必然会导致肿瘤微环境中的葡萄糖不足,这对LC细胞是不利的。因此,这些恶性细胞需要替代代谢燃料。目前尚不清楚果糖(饮食中的一种丰富的糖)是否承担这一角色。

华盈生物合作伙伴上海中医药大学附属龙华医院陈文连/贾立军教授联合研究团队最新发现,果糖转运体GLUT5在肺癌转移患者肿瘤组织中高表达,并介导了果糖代谢通路的激活,进而抑制细胞能量感受器AMPK,并活化其下游的mTORC1信号通路,促进肺癌细胞恶性生长的新机制,相关研究成果于2020年2月初发表于国际期刊《JCI Insight》上。

 

本研究选用了华盈生物的PEX100磷酸化广谱筛选抗体芯片技术

 


1. 代谢组学:分析肺癌病人异常果糖代谢现象


为了评估体内LC的果糖代谢活性,作者招募了ADC(n=22)和SCC(n=13)两类LC患者(图1A),并对这些患者的肿瘤组织和癌旁正常组织进行了代谢组学研究。研究发现在LC组织中,果糖水平、果糖与葡萄糖的比率以及果糖衍生的代谢物,包括1-磷酸果糖和磷酸二羟丙酮(DHAP)均升高(图1B,1C)。因此,作者假设在体内,当葡萄糖缺乏时,LC细胞可以改用循环中的果糖

1.png2.png
图1 体内LC果糖利用活性的研究




为了验证这一假说,作者进行了体外果糖摄取实验。当培养基葡糖糖充足(6 mM)时,正常组织(N)和肿瘤组织(T)均表现出低果糖摄取率。而当葡萄糖含量低或缺乏时,T显著上调其果糖消耗率(图1D)。这些结果表明,果糖是一种供选择的碳源,在限糖条件下,LC组织的果糖代谢增强,而与之相对的正常组织则没有表现出这种果糖成瘾的特征。

 

2. TCGA分析:发现果糖转运蛋白GLUT5 在肺癌肿瘤组织中高表达

果糖主要通过两个主要的果糖转运蛋白GLUT2和GLUT5进入细胞,这两个转运蛋白分别由溶质载体家族2成员2和5(SLC2A2和SLC2A5)编码。研究人员对比了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的RNA-Seq数据和基因表达谱芯片数据,发现SLC2A2在ADC和SCC患者的LC组织中的表达没有明显变化(图2A,2B),而SLC2A5却显著上调(图2C,2D)。作者的Western结果也显示SLC2A5的蛋白产物GLUT5表达水平也显著升高(图2E,2F)。


3.png

4.png

图2  LC患者组织中GLUT2和GLUT5表达情况



3. 临床样本IHC:发现GLUT5蛋白高表达与预后呈负相关

此外,作者还对ADC和SCC两类LC患者进行免疫组织化学(IHC)检测,结果发现GLUT5在LC患者组织中表达上调(图3A,3B)。值得注意的是,IHC染色表明GLUT5高表达的LC患者生存预后不良(图3C,3D)。


5.png

图3 LC组织和正常组织中GLUT5表达情况

4. 果糖代谢分析:发现GLUT5直接影响果糖摄取并促进LC细胞增殖


随后,为了验证GLUT5是否介导了体内LC的果糖摄取,作者对A549和EKVX细胞进行SCL2A5基因敲除(图4A)。体外实验中,发现SLC2A5缺失显著抑制果糖摄取和果糖诱导的细胞增殖,而对葡萄糖摄取和葡萄糖诱导的细胞增殖影响不大(图4B,4C)。体内实验中,代谢流技术观察发现移植瘤SLC2A5缺失可降低13C-果糖水平并抑制LC异种移植瘤的生长(图4,D-F)。


 


图4 SLC2A5缺失对LC细胞果糖摄取及增殖影响

 

5. 代谢流分析:GLUT5介导脂肪酸代谢途径稳定性

为了阐明果糖是否直接参与脂肪酸的合成,作者进行了体内代谢流测定。将1M [U-13C6]-d-fructose通过小鼠尾静脉注入,并追踪A549异种移植瘤中的果糖下游代谢产物。结果发现,在缺失SLC2A5的A549肿瘤中,13C-丙酮酸、13C-乙酰辅酶A和13C-棕榈油酸减少,而在GLUT5过表达的A549肿瘤中,这些代谢物则反向上调(图5,A和B)。这些发现表明,在肺部肿瘤中,吸收的果糖被用来合成脂肪酸,包括棕榈油酸。

 

8.png

图5 SLC2A5对果糖下游脂肪酸代谢途径的调控

 

6. 抗体芯片:确定GLUT5促进LC恶性增殖信号通路

为了全面了解果糖利用诱导LC生长的分子机制,作者利用华盈生物提供的PEX100磷酸化抗体芯片技术(可筛选31条信号通路)对SLC2A5缺失的A549肿瘤移植瘤和对照组的A549肿瘤移植瘤组织中的磷酸化谱进行广泛筛选,检测特定位点的蛋白磷酸化事件,并识别调控LC生长的下游底物/效应物。与对照肿瘤相比,SLC2A5缺失在A549肿瘤中引起了广泛的磷酸化蛋白谱的变化,其中磷酸化水平升高50%以上的蛋白有82个,磷酸化水平降低50%以上的蛋白有46个。在SLC2A5缺失的A549肿瘤中磷酸化水平改变的蛋白中,以辅酶A羧化酶1(ACC1)的蛋白表达最高,在Ser79处磷酸化水平增加达到838%以上。而ACC1是AMPK众所周知的下游靶点。相应地,抗体芯片显示AMPK也被显著激活,上调1.95倍(图6A)。前人研究表明,AMPK下游的mTORC1蛋白是促进LC恶性生长的重要调控蛋白。在本研究中,抗体芯片结果显示受mTORC1调控的两个最重要的蛋白4E-BP1和p70S6K的磷酸化在SLC2A5缺失的A549肿瘤中也被显著抑制(图6A),说明了mTORC1通路受到了GLUT5的调控。作者利用Western blot方法验证了抗体芯片结果(图6B)。

9.png

图6 抗体芯片分析SLC2A5对AMPK/mTORC1信号通路的调控

 

7. Rescue实验:证实GLUT5直接调控AMPK/mTORC1信号通路

为了进一步证实GLUT5介导的果糖利用可能影响AMPK/mTORC1信号通路,作者将对照组A549细胞和SLC2A5基因敲除的A549细胞在无糖培养基中饥饿2h,以刺激AMPK,抑制mTORC1活性。然后在培养基中分别加入果糖和葡萄糖,最终浓度为6 mM,处理细胞1h。在果糖条件下,对照A549细胞可以用果糖抑制AMPK活性,上调mTORC1活性,而SLC2A5缺失的A549细胞由于丧失了果糖利用能力而没有表现出这种信号改变(图7A和B)。此外,为了验证激活的AMPK是否阻碍LC细胞的生长,作者使用AMPK激动剂AICAR来异常刺激AMPK,从而降低A549细胞中mTORC1的活性(图7C)。可以发现A549细胞的增殖受到AICAR处理的显著抑制(图7D)。总之,LC细胞需要GLUT5介导的果糖利用来抑制AMPK,激活mTORC1活性,从而促进LC细胞的生长。

10.png

图7 GLUT5是激活AMPK/mTORC1通路的主要靶点

 

小结

本研究充分利用了非靶向代谢组学筛选、代谢流、抗体芯片技术(华盈生物均可提供服务)发现了肺癌恶性生长的双重机制:首先利用代谢组学技术发现了肺癌患者果糖摄入增加的特殊现象,并利用代谢流等技术证实了果糖转运蛋白GLUT5一方面通过增加果糖摄入,促进脂肪酸合成途径,为肺癌细胞提供补充能量的明确机制。另一方面GLUT5引起的果糖摄入增加抑制了AMPK的活性,进而促进了mTORC1通路的激活,导致肺癌恶性增殖的机制(图8)。

11.png

图8 GLUT5促进肺癌恶性增殖的双重机制

本研究实验设计思路清晰,层层递进;实验方法应用合理,推陈出新;实验结果全面可靠,非常值得华盈视角推荐。

  

文献原文:GLUT5-mediated fructose utilization driveslungcancer growth by stimulating fatty acid synthesis and AMPK/mTORC1 signaling.