文献赏析

华盈生物:肺结核诊断标志物研究新突破

2019/11/14

        肺结核被列为引发全球人口死亡的十大原因之一,每年造成全球约170万人死亡。最近在非洲和亚洲的流行率调查显示,多达三分之一的活动性肺结核(ATB)患者未被确诊,因而未得到治疗,迫切需要改进诊断方法,以便发现、治疗从而减轻活动性肺结核的巨大全球健康负担。近日来自哈佛大学和麻省理工学院Broad研究院等研究机构的研究人员,应用Luminex平台和Simoa超高灵敏蛋白检测技术,开发出一种基于血液的检测方法可用于诊断活动性结核病,相关研究发表在最新一期国际顶级期刊《Science Translational Medicine》上,PMID: 31645455。


华盈视角为您倾情解读

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                研究机构:哈佛大学和麻省理工学院Broad研究院、哈佛医学院布列根和妇女医院等

   •   研究背景

        目前结核病的检测技术是对病人的痰液进行显微镜检查,并用Ziehl-Neelsen抗酸染色的技术,这种方法灵敏度不足且依赖于操作人员技术,并且固体或液体培养方法缓慢,对实验室基础设施有要求,限制了在结核病高发但资源有限的环境中使用。此外,两个最脆弱和受影响最大的群体,即感染艾滋病毒的儿童和成人,由于难以获得痰液且样本中的细菌含量低,不太可能用痰液来诊断。一些商业血液检测试剂试图填补这一空白,但有证据表明这些检测准确度不高,世界卫生组织强烈建议不要使用这些商业化检测试剂盒用于诊断肺结核。因此目前急需一种快速、简单、低成本、高灵敏度的诊断方法。

   •   研究方法 :

       Discovery Cohort:使用Luminex多因子检测平台筛选387例结核病症状患者血浆中的47种宿主炎症蛋白,结合机器学习算法筛选到4种与活动性结核病相关的蛋白。

       Validation Cohort:进一步利用Simoa超高灵敏蛋白检测技术检测样品(N=406)并优化模型。

       Verification Cohort:利用Simoa技术对317例双盲血液样品进行诊断模型验证和评估蛋白标注物性能,从而区分活动性结核病和其他结核病相似类的疾病。

   •   研究结果 :


1、 基于免疫蛋白测定和机器学习算法发现潜在标志物

       采用Luminex多因子检测技术对387结核病患者血浆样本进行47种宿主蛋白的分析(其中199 例活动性结核病(ATB)、188 例其他持续性咳嗽的活动性结核病类似症状的疾病(OTD))。过滤掉缺失值大于50%的蛋白,并根据其在血浆中的浓度对候选标志物进行分层后,使用TreeNet机器学习算法进行10倍交叉验证,以12种蛋白为基础建立模型(表1a)。TreeNet算法筛选到四种蛋白质标志物:IL-6、IL-8、IL-18和VEGF,建立一种ATB诊断模型,其准确度为0.87,敏感性86%,特异性65%(表1b)。

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表1 Discovery 和Validation Cohort建立ATB诊断模型


2、 基于超高灵敏检测Simoa技术改进ATB诊断模型

      尽管基于Luminex检测结果构建的算法在发现队列中的表现出令人鼓舞的性能,但Luminex分析平台的分析灵敏度有限,意味着许多血浆样本部分蛋白质(包括标志性蛋白IL-6、IL-8、IL-18和VEGF)存在缺失值(低于Luminex分析的检测限)。因此,最佳分析物的全动态值范围无法被用于生成分类算法。为了解决这一局限性,研究人员选用了Simoa超高灵敏技术平在Validation Cohort阶段检测这四种蛋白标志物(样品数量N=406,其中199 例ATB、188 例OTD、19例治愈对照组),以获得连续性检测数据。

        结果发现ATB的蛋白质浓度显著高于OTD和治愈对照组,ATB中IL-6的平均浓度约为OTD的4倍。19个治愈对照组的IL-6平均浓度远低于ATB组。ATB与OTD患者相差2.4倍。IL-8和VEGF的表达模式相似(图1)。研究人员表示,如预期的那样,与Luminex技术相比,Simoa对每种分析物的分析灵敏度高出几个数量级,在很大程度上消除了最初Discovery Cohort的缺失值问题,并有可能实现通过指尖获得的血量进行检测。

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图1 Simoa检测的标志物蛋白浓度连续分布情况——Discovery Cohort

       由于Simoa超高灵敏度改变了血浆蛋白的检测阈值,可以获得全动态值范围的连续性检测数据,利用TreeNet机器学习算法与Simoa衍生数据集重新进行10倍交叉验证,结果显著改善了ATB诊断模型的性能:交叉验证准确度为0.85(ROC-AUC),敏感性为87%,特异性为66%(表1c、图2)。

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图2 基于Simoa数据集的ATB诊断模型ROC判别


 

  3、 ATB分类算法的验证

       为了验证该诊断模型并评估其性能,利用Simoa技术,使用来自三个国家的317例完全独立的双盲实验收集的临床血液样本评估了四种蛋白标志物。与Discovery Cohort一样,Validation Cohort阶段的ATB组、OTD组和治愈对照组的IL-6、IL-18和VEGF浓度存在显著差异(图3)。TreeNet算法的准确度(ROC-AUC)为0.80,敏感性为80%,特异性65%(表2C),所有数据均有超高灵敏技术Simoa获得。

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图3 Simoa检测的标志物蛋白浓度连续分布情况——Verification Cohort


   •   小结 :

       研究人员将Luminex多因子检测技术与Simoa超高灵敏蛋白检测技术联合起来,利用了Luminex多因子检测技术的高通量以及Simoa技术的超高灵敏度,找到了区分活动性结核病和其他结核病相似症状疾病的血液中生物标志物,研究思路清晰、新颖,值得推荐!


 

 •   技术路线:
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        面对外周血蛋白标志物开发的研究需求,华盈生物发挥核心团队标志物研究的背景优势,站在研究人员的角度思考问题,打造了一套完整的蛋白标志物研究服务体系:我们从实验初期数千种蛋白质的高通量筛选(固相芯片),到实验中期数百例样本多指标的大规模检测(Luminex),再到特定低丰度指标的超灵敏动态监测(Simoa),均能够提供相应的技术平台和支撑,构建了1+1+1>3的服务格局。

       目前,华盈生物已完成上万例样品的测试和分析工作,样品类型超过30种。根据自主建立的细胞因子测试数据库为客户匹配合适的产品,优选实验实施方案,大幅度提高了实验的总体成功率。根据特定的研究目的,华盈生物还可提供超过400种细胞因子的个性化和组合检测,全方位满足不同研究人员的实验需求。


如有相关研究需求,欢迎垂询:021-33938791-8010(郭博士)
英文链接:

https://stm.sciencemag.org/content/11/515/eaaw8287.short