文献赏析

华盈视角:可变剪切-信号通路与胶质瘤发病机制研究

2019/07/05

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(剪接因子SRSF1通过MYO1B致癌剪接转换促进胶质瘤形成)

本文涉及磷酸化抗体芯片技术及其关键生物信息分析由华盈生物提供


       基因的异常剪接与肿瘤的发生密切相关, 由剪接因子改变引起的异常选择性剪接(AS)有助于肿瘤进展。丝氨酸/精氨酸富集剪接因子1(SRSF1)是选择性剪接因子家族的代表性成员,主要参与前体mRNA的剪接与加工、mRNA的运输、细胞周期、凋亡的调控等生理功能。但其在胶质瘤中的作用和机制尚不明确。本研究中,天津医科大学于士柱教授研究团队使用RNA-seq、CO-IP等技术,首先找到了SRSF1通过AS调控的基因MYO1B(肌球蛋白B)。并进一步证实,MYO1B经过AS后会形成MYO1B-fl蛋白,表达于细胞膜,并促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。通过华盈生物磷酸抗体芯片CSP100筛选,研究人员快速找到了介导MYO1B-f蛋白促胶质瘤细胞的增殖和侵袭的关键通路: PDK1/AKT和PAK/LIMK,为揭示胶质瘤形成与发展提供了重要证据。文章近期发表在JCI杂志上(PMID:30481162)。

 
华盈视角解读:
1. SRSF1在胶质瘤中的高表达预示着预后病情恶化

       本研究首先通过基因测序分析, 初步探讨SRSF1基因与胶质瘤组织病理特征的相关性。从mRNA的定量水平显示,与正常组织相比,胶质瘤组织SRSF1mRNA表达水平显著升高(图1A),同时WB结果显示,在组织和细胞层面上均证明与正常组比较,SRSF1 蛋白水平上也显著增高(图1B)。同时发现,SRSF1的表达与增值指标Ki67呈现正相关(图1C),一致显示,SRSF1的上调与胶质瘤发生发展密切相关,预示SRSF1是胶质瘤患者的潜在预后生物标志物。


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图1 SRSF1在胶质瘤中的高表达预示着预后病情恶化

 

2. SRSF1增加神经胶质瘤细胞的致瘤潜力

        进一步,为了深入探究SRSF1是否对胶质瘤具有致癌作用,研究人员对4种胶质瘤细胞(U87MG、U251、LN229和SNB19)的中SRSF1进行有效敲除(图2A)。与对照siRNA相比,干扰掉剪接子SRSF1后显著抑制了这些细胞的生长。(图2B)。


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图2 SRSF1增加神经胶质瘤细胞的致瘤潜力


       为了进一步确认SRSF1是否在SRSF1介导的过程中起重要作用,研究人员设置一系列实验组和相应的对照组别:WT+vec(共表达荧光素酶的慢病毒)、KD+vec(SRSF1 shRNA)、KD+ SRSF1-mu(SRSF1-mu感染KD亚细胞系)、vec、WT+vec、KD + vec(图3A)。体外和体内实验。同样证实了之前的结论,SRSF1基因敲除严重抑制了细胞增殖,存活率、侵袭能力,而SRSF1恢复显著修复上述缺陷(图3B、3C)。这些结果表明SRSF1对胶质瘤细胞的增殖、存活和侵袭是一种有效的启动子。

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图3 SRSF1增加神经胶质瘤细胞的致瘤潜力


3. SRSF1影响AS基因表达的全面调控

       为了探究SRSF1在胶质瘤发育中调控的AS事件,通过对U87MG和U251的WT和KD亚细胞进行RNA高通量测序。共鉴定出1348和1332个SRSF1调控的事件。这些AS事件分为5类,主要的事件属于跳跃的外显子(SE)类别(图4A/4B)。随后的分析表明SRSF1具有双重作用剪接激活剂和抑制剂(图4C)。重要的是,这些重叠的受SRSF1影响的多数剪接靶标参与细胞骨架组织和黏附区域中的肿瘤相关功能(图4D/4E)。

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图4 SRSF1影响AS基因表达的全面调控


4. 探究SRSF1诱导的AS机制 

       研究人员随后验证了U87MG和U251细胞共同调控的前50个受SRSF1影响的AS事件。RT-PCR验证了12个AS事件的代表性结果。这些结果证实SRSF1激活(图5A)或抑制(图5B)靶外显子/内含子的剪接。进一步,通过免疫沉淀及RT-PCR结果验证SRSF1与肌球蛋白IB(MYO1B)外显子23和24有结合。SRSF1敲低显著导致2个相邻外显子的跳跃并促进截短的MYO1B(MYO1B-t)同种型的表达,同时发现,全长MYO1B蛋白(MYO1B-fl)敲低能够有效抑制GBM细胞的生长而非MYO1B-t(图5C)。最终显示, MYO1B-fl水平表达量增高与SRSF1表达相关联。

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图5 探究SRSF1诱导的AS机制


5. SRSF1诱导的MYO1B剪接通过PDK1/AKT和PAK/LIMK通路决定细胞命运 

       为了更好地理解由SRSF1敲低带来的抗癌作用机理,研究人员采用华盈生物提供的磷酸化抗体芯片技术CSP100,快速筛选SRSF1敲低的胶质瘤细胞中12条经典肿瘤信号通路的调变情况(图6A)。以调变15%为cut off值(图6A),研究人员找到了一系列与肿瘤增殖及侵袭相关的通路蛋白发生了显著调变。其中,就包含AKT、Actin、MAPK等肿瘤增殖及侵袭关键通路中的主要蛋白磷酸化明显下调(图6B)。进一步,将MYO1B-fl过表达后(Rescue实验),利用Western blot实验对这些蛋白进行验证,发现SRSF1敲低带来的磷酸化下调得到显著恢复,说明这些通路及分子是介导SRMF1/MYO1B-fl致癌作用核心通路(图6C)。

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图6 SRSF1诱导的MYO1B剪接通过PDK1/AKT和PAK/LIMK通路决定细胞命运
 

小结
       
本文是一篇经典的新基因功能研究范文。研究人员发现可变剪切蛋白SRSF1在细胞核内调控MYO1B基因的可变剪切,其终产物全长MYO1B蛋白(MYO1B-fl)表达于细胞膜上,可进一步介导胶质瘤的增殖和迁移。

       然而,作为可变剪切蛋白,MYO1B-fl非常新,没有文献对其在胶质瘤中的促癌功能和机理进行过相关报道。MYO1B-fl如何调控胶质瘤的增殖和迁移?研究人员需要从零开始。寻找能够传递MYO1B-fl信号的经典通路是关键一步,面对多条信号通路筛选难题,研究人员果断运用华盈生物提供的磷酸化抗体芯片技术来筛选SRSF1敲低后多条经典肿瘤相关信号通路的变化,成功锁定PDK1/AKT和PAK/LIMK通路,并最终揭开SRSF1复杂的促癌机制(图7)。

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图7 机理总结图


启示

        本研究实验设计十分经典,为其他研究人员的类似研究提供了很好的技术范本,尤其当生物现象背后涉及到复杂信号通路变化时,华盈生物提供的广谱信号通路磷酸化抗体芯片可以为科研人员节省大量时间,并能够在复杂信号网络中锁定到关键核心蛋白及磷酸化位点。 华盈生物的PEX100芯片及CSP100 plus芯片,一次芯片实验即可实现多达31条或16条信号通路的同步筛选,由此成为此类研究中信号通路研究阶段的首先技术。

 

英文文献链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6355305/