文献赏析

华盈视角:蛋白质组芯片应用于抗肿瘤新机制研究

2018/07/12

应用芯片类型-20K.png


       PTEN是肿瘤研究里炙手可热的明星分子,由于其可以通过脂质磷酸酶功能抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的活性,成为迄今最重要的肿瘤抑制基因之一。最近研究表明,缺失磷酸酶活性的PTEN突变体仍然具有较强的肿瘤抑制功能,同时,定位于细胞核内的PTEN蛋白可以通过磷酸酶非依赖途径发挥肿瘤抑制功能。但是,目前关于核PTEN的抗肿瘤作用的分子机制知之甚少。
上海华盈生物合作伙伴——上海交通大学医学院陈国强院士研究团队成功运用人类蛋白质组芯片技术,发现并证实了核蛋白PTEN与剪接体蛋白的相互作用,通过影响高尔基体的伸展和分泌来发挥其肿瘤抑制作用的新机制,为PTEN基因的研究增添了浓墨重彩的一笔。相关研究成果近期发表在国际顶级学术期刊《Nature Communications》(PMCID: PMC6008332)上。

 

文章图.png


文献解读

1、PTEN调节的选择性剪接事件(ASE)与癌症相关

基因在真核生物中的表达受RNA各个环节的复杂过程的精细控制。在这些过程中,关键步骤之一是pre-mRNA(前体mRNA)的组成剪接形成成熟的信使RNA(mRNA)。在此过程中的另一个调控是选择性剪接(AS),剪接是由剪接体完成,剪接体是由五个小核糖核蛋白(snRNP:U1,U2,U4,U5和U6)和200多个辅助蛋白组成的RNA和蛋白质的大复合物,剪接体的组分变化会造成基因突变或表达改变,导致疾病的发生。AS的主要作用之一是通过合成各种具有不同生物活性的蛋白质异构体使蛋白质组多样化。AS在不同的组织和发育阶段受到严格的控制,其调控异常与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。

PTEN作为最重要的肿瘤抑制基因之一,在剪接中发挥重要作用,为了评估PTEN对AS的潜在影响,研究人员对PTEN缺失或未缺失的293T细胞的总RNA(利用两对shRNAs进行PTEN缺失;shPTEN#1或shPTEN#2 与非特异性shRNA作为阴性对照shNC)进行RNA-seq检测,其中262个AS事件(ASE)代表208个人的基因检测到显著变化(1b)。为了确定PTEN调节的ASE是否发生在人类肿瘤中,将这262个ASE与癌症基因组图谱(TCGA)比较,结果显示有80个ASE与癌症相关(ASE频率>5%即相关)1a),并且鉴定出20个ASE与PTEN的拷贝数相关(1c)。基于以上分析,发现60%(12/20)PTEN相关的ASE也与癌症相关1d)。为了选择用于深入功能分析的候选基因,对PTEN和癌症相关的ASE进行WB和RT-PCR验证。结果显示共有3个ASE(对应3个基因,GOLGA2KIF21A和C2CD5)发生选择性剪接(1e)。

 

图1.png

图1  PTEN调控的ASE与癌症相关

 

2、核PTEN直接与剪接体蛋白U2AF2相互作用

那么,PTEN是怎样调控ASE呢?

研究人员利用CO-IP对293T细胞核提取物进行亲和纯化,并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析结合的蛋白质,鉴定到136个与核PTEN相互作用的蛋白质。其中,38个属于剪接体的组成成分,包括三种主要的小核糖核蛋白(snRNP:U1,U2和U5),EJC/TREX,PRPF19-CDC5L复合物和两类RNA结合蛋白,富含丝氨酸/精氨酸(SR)的蛋白质和核内不均一蛋白(hnRNPs)(图2a)。

因为PTEN缺失没有显著改变剪接体蛋白的表达(WB图未显示),推测PTEN可能在剪接体组装期间发挥作用。应用qRT-PCR检测MEF细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)中所有五种剪接体snRNA的表达,发现在PTEN敲除时,只有U2 snRNA的丰度显著降低,表明PTEN缺失导致剪接体组装期间U2 snRNP的募集减少,也证实了U2 snRNPPTEN的结合(图2b)。

为了确定在剪接体组装过程中PTEN调节的U2 snRNP募集的直接机制,研究人员试图在剪接体特别是在U2 snRNP中鉴定PTEN的结合蛋白谱。为了排除PTEN与剪接体的关联是通过RNA介导的可能性,将293T细胞的核提取物用RNase处理,CO-IP显示所有剪接体蛋白在有无RNase存在的情况下,被PTEN抗体免疫沉淀的程度相似,表明PTEN-剪接体的关联主要涉及蛋白质-蛋白质相互作用机制(图未显示)。

为找到PTEN蛋白的直接结合蛋白,研究人员与华盈生物合作,采用Huprot 20K人类蛋白质组芯片(覆盖2万种人类全长蛋白),鉴定出与PTEN蛋白直接结合的712种相互作用蛋白(图2c),包括已知的PTEN相互作用蛋白USP7(HAUSP7),WWP2和APC3(CDC27)。KEGG通路分析表明PTEN结合蛋白中富集度最高的为9种剪接体蛋白(图2a),,其中5种蛋白U2AF2,SF3B4,HNRNPC,HNRNPK和HNRNPU在前述的CO-IP测定的136个蛋白中也被鉴定到(图2d),表明PTEN可以与这五种剪接体蛋白直接相互作用。其中U2AF2通常被认为在向剪接体募集U2 snRNP中起重要作用,GST pulldown结合Western blot实验证明两者可以直接相互作用(图2e)。

 

图2.png

图2  核PTEN直接与剪接体蛋白U2AF2相互作用

 

3、PTEN缺失诱导GOLGA2选择性剪接,促进高尔基体伸展和分泌

以往研究中,PTEN从未与高尔基体相关联。高尔基体作为细胞分泌途径的中心细胞器,连接上游(内质网)或下游(内体,溶酶体),并在所有新合成的分泌蛋白和跨膜蛋白的翻译后修饰、分选和运送中起重要作用。这种分泌途径正在用于开发抗癌疗法的新靶点。作为PTEN缺失引起的异常剪接导致的后果之一,GOLGA2的AS为我们提供了初步了解PTEN和高尔基体之间关系的机会。RNA-seq分析显示293T细胞表达新的GOLGA2同种型,GOLGA2L外显子2b处发生剪接跳跃的GOLGA2S(图3a)。RT-PCR表明在检测细胞系中,GOLGA2LGOLGA2S丰度更高,且PTEN缺失导致细胞中GOLGA2S的含量显著增加(图3b)。此外,U2AF2的敲低也会诱导GOLGA2在外显子2b处发生剪接跳跃(图3c),表明外显子2b是由PTEN和U2AF2共同调控。因此,PTEN的缺失破坏了U2AF2的募集,导致剪接体的结构不完整,结果是GOLGA2发生剪接跳跃。外显子2b剪接跳跃的结果是高尔基体池厚度减少,延伸更长(图3d,3e)。接着利用ts045-VSVG-EGFP(具有从ER移出到高尔基复合体中的能力,并且在温度降低到32℃时最终到达质膜,因此已被广泛用于研究膜转运)研究高尔基体分泌,结果显示PTEN缺失促进高尔基体分泌(图3f)。

 

图3.png

图3  PTEN通过GOLGA2外显子2b剪接调控高尔基体伸展和分泌

 

4、PTEN缺失使癌细胞对分泌抑制剂敏感

研究人员进一步研究了GOLGA2S对肿瘤生长的影响。发现PTEN缺失促进肿瘤生长,敲低GOLGA2S也会抑制这种生长现象(图4a,4b),因此GOLGA2剪接有助于PTEN缺失诱导的分泌和肿瘤生长。接着研究人员用两种分泌抑制剂BFA和GCA处理PTEN+/+PTEN-/- MEF细胞。结果显示,一旦达到一定的浓度(BFA为1μg/ ml,GCA为8μg/ ml),BFA和GCA对PTEN-/- 细胞抑制作用更明显,表明分泌抑制剂BFA和GCA能够选择性地杀死PTEN缺失的肿瘤细胞(图4c)

 

图4.png

图4  PTEN删除使癌细胞对分泌抑制剂敏感

 

小结:

在本研究中,利用人类蛋白组芯片技术找到PTEN的直接结合蛋白U2AF2对于揭开核PTEN抗肿瘤机制的大幕十分关键。作者先后尝试过CO-IP结合质谱、酵母双杂交等经典的实验策略,均未得到有意义的创新性结果。利用华盈生物推出的人类蛋白组芯片技术,2周内便获得712种PTEN直接结合蛋白,效率之高超过所有传统技术。人类蛋白组芯片在筛选互作蛋白研究中具有如下特征性优势

1. 芯片实验为体外实验,芯片上每个蛋白点相互独立,保证筛选到的互作蛋白均为目标蛋白的直接结合蛋白,数据分析简单;

2. 体内环境复杂,很多蛋白结合现象稍纵即逝,很难捕捉,利用体外环境条件下的筛选,可以很快发现很多潜在结合靶标,结合每个蛋白的生物学功能再进行后续实验验证的实验策略更加高效,数据也更加全面。

3. 在不同组织、细胞、细胞器中,蛋白的表达丰度差异很大,传统的CO-IP等实验很难发现低丰度蛋白的互作现象,人类蛋白组芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白,可以保证每种蛋白的丰度,芯片实验容易发现潜在蛋白互作现象。

4. 利用人类蛋白组芯片实验筛选互作蛋白,从蛋白质层面分析互作数据,避免了CO-IP后质谱鉴定时,从多肽水平跨层分析互作蛋白的不确定性和复杂性。

5. 相比酵母双杂交实验,蛋白芯片实验周期短、假阳性率低,方便复杂实验设计,可以设计多种实验对照,更能确保互作蛋白数据的准确性。

 

英文文献链接:https://www.nature.com/articles/s41467-018-04760-1