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lncRNA机制大开发--走进HuProt™ 20K 新时代!

2015/07/27

      长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是长度大于200个核苷酸的不具备编码蛋白质功能的基因转录产物。LncRNA一般具有以下特征:通常较长,有mRNA样结构, 经过剪接具有polyA尾与启动子结构;LncRNA启动子可结合转录因子,如Oct3/4、Nanog、CREB、Sp1、c-myc、Sox2及p53;大多LncRNA在组织分化发育过程中都有明显的时空表达特异性。根据LncRNA在基因组上的位置,可以将其主要分为(1) sense (2) antisense (3) bidirectional (4) intronic (5) intergenic这5种类型(图1)。

                       

图1. 编码RNA(蓝色)和非编码RNA外显子(橘色)示意图

 

为什么要研究LncRNA?
           
                 根据科学家对人类基因组的研究,95%的人类基因组属于非编码RNA。ncRNA与多种病变密切相关,在生命过程中发挥重要作用。目前LncRNA研究数据呈爆炸性增长,一些富有意义的研究成果已出现(图2),人们逐渐意识到LncRNA是个有待开发的富饶宝矿。识别新的LncRNA,解开LncRNA新的生物学功能,能够加快人类理解生命奥秘的步伐。

 

图2. PubMed 输入LncRNA关键词搜索到的论文数量

 

怎样研究LncRNA?

 

      科学研究表明,LncRNA在表观遗传控、细胞周期控和细胞分化调控等众多生命活动中都发挥重要作用,其具体调控机制可归纳为8种主要途径(图3)。然而,目前研究表明LncRNA发挥其生命调控功能,主要通过与相关功能蛋白的结合介导,即LncRNA-Protein相互作用(如图3虚框部分)。因此,找到LncRNA的结合蛋白是揭开LncRNA神秘面纱的关键步骤。

                     

图3. LncRNA作用机制示意图
           (Wilusz JE1, et al. Genes Dev. 2009, 23:1494-504)

 

LncRNA-Protein互作研究常规技术:

 

      目前,LncRNA-Protein相互作用常用研究技术有:RIP,CHIRP,CHART,catRAPID,EMSA,RNA-pull down等,但这些分析方法往往具有不同的局限性,例如实验步骤复杂,受影响因素多,需进行体外的细胞培养和转染实验,实验效率低,覆盖范围小,耗时费力,实验结果不稳定等。
                
HuProt™ 20K人类蛋白质组芯片技术可有效克服传统实验方法的设计缺陷,逐渐成为LncRNA结合蛋白筛选的主流技术。HuProt™20K人类蛋白质组芯片上共价结合有19394种人类全长蛋白质,实验过程中(图4),科研人员只需通过化学合成法(图5)或体外转录方法获取LncRNA(图6),荧光标记后直接与HuProt™20K芯片孵育杂交。通过分析芯片上各蛋白结合探针的荧光信号强度,便可直接识别LncRNA的结合蛋白。

 

     

图4. 蛋白芯片与LncRNA研究实验流程

 

 

           1、核苷酸反应,脱去核苷酸5-羟基的DMT,暴露5-羟基
           2、合成原料与活化剂混合得到活化中间体,3'端被活化
           3、活化中间体与游离的5-羟基缩合,寡核苷酸链延长
           4、带帽反应,乙酰化封闭未反应的与CPG相连的5-羟基
           5、添加氧化剂碘使亚磷酰变为更稳定的磷酸三酯

图5. LncRNA探针制备方法一:化学合成法

 

           1、提取DNA质粒(具有T7/T3/SP6启动子位点)
           2、线性化质粒(利用单一酶切位点线性化利于转录)
           3、反应液中进行体外转录,在37℃-42℃下放置2小时
           4、通过非变性琼脂糖检测转录产物
图6. LncRNA探针制备方法二:体外转录法

 

蛋白质组芯片筛选LncRNA结合蛋白的优势:

           1. 无需进行体外的细胞培养和转染实验;
           2. 无需进行免疫沉淀实验,不受共沉淀效率影响;
           3. 较EMSA和RIP实验效率更高,更适合筛选需求;
           4. 直接定位互作蛋白,无需进行质谱鉴定和验证;
           5. 实验简便、快速可靠,各蛋白背景信息清晰,验证效率高;
           6. 体外实验,覆盖范围更广泛,可鉴定出更多互作蛋白类型和靶点。
                                                                                                                                             

                                       

 

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应用蛋白质组芯片研究LncRNA经典案例解析:
           
           1、蛋白质组芯片应用于LncRNA调控机理研究 (详细内容点击进入)

案例简介:
                 神经元激活后会释放DISC1和ERBB4等基因的变异剪切体,进而导致精神分裂症(SZ)的发生,而这些基因变异剪切体的成因尚不明晰。研究人员利用KCL将小鼠神经元去极化激活,通过基因芯片筛选到LncRNA-Gomafu显著下调,并证实LncRNA-Gomafu的下调与DISC1、ERBB4变异剪切体的增加直接相关。
                 进一步,通过
HuProt™20K人类蛋白质组芯片技术,研究人员迅速找到LncRNA-Gomafu可与基因变异剪切蛋白QKI、SRSF1直接结合。由此解释了LncRNA-Gomafu作为脚手架通过结合SF、QKI和SRSF1等变异剪切蛋白,调控DISC1、ERBB4基因的变异剪切,进而导致SA发生的完整疾病机理。

 

2、蛋白质组芯片应用于LncRNA与视网膜发育调节研究 (详细内容点击进入)

案例简介:
                 前人研究表明,Six3基因在视网膜发育过程中起着至关重要的作用,而本文作者发现LncRNA-Six3OS和Six3基因在视网膜前体细胞中存在共表达。通过RNAi抑制和过表达双向实验,研究人员证实Six3是LncRNA-Six3OS下游基因,并能通过Six3调控眼底双极细胞和胶质细胞的发育。
                 进一步,研究人员在15种人类及小鼠视网膜细胞中排除了LncRNA-Six3OS是通过调控Six3的mRNA和蛋白表达的方式影响视网膜细胞的发育,进而将研究目光聚焦到LncRNA-Six3OS对Six3蛋白活性的调控上。通过
HuProt™ 20K人类蛋白质组芯片技术,研究人员迅速筛选到LncRNA-Six3OS可直接结合Ezh2和Eya家庭成员。而Eya家族成员作为组蛋白修饰酶复合物在Six3的引导下可以与Six3下游的靶基因启动子区结合从而调控其基因表达引发视网膜发育不全。而LncRNA-Six3OS与Ezh2和Eya家庭成员的结合则解释了LncRNA-Six3OS作为脚手架蛋白招募Six3和组蛋白修饰酶直接调控Six3下游基因表达而不影响Six3基因自身表达的新机制。