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    凝集素蛋白芯片

           
            凝集素(Lectin是一类自然界广泛存在的蛋白质,具有特定糖结构识别的特性。糖蛋白和糖脂上发生的糖基化修饰,在细胞分化、病原微生物侵袭,以及肿瘤的发生、发展和迁移等生物现象中扮演着极为重要的角色。利用凝集素进行特定糖结构的解析是糖生物学研究领域的常用手段。本芯片将可商业获得的多种经典凝集素,以微阵列的形式固定在高分子三维芯片片基上,形成高通量凝集素芯片,可进行多种糖结构的同步筛选和交叉验证。该芯片的诞生为专注于分析细胞表面糖基化及蛋白质糖基化研究的科学家提供了极佳的工具。

     

    Sharon N,et al.Glycobiology. 2004

    凝集素芯片列表


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    凝集素芯片应用

     

    1. 特定蛋白表面糖谱构建及差异检测;
    2. 活细胞表面糖谱构建及差异检测;
    3. 细胞或组织裂解液糖谱构建及差异检测;
    4. 临床样本的糖谱检测与生物标志物发现;
    5. 与质谱技术联用研究糖基化蛋白质组。

     

     

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    凝集素芯片实测结果(以70种凝集素为例)

           
            如芯片扫描图所示,BANLEC、BC2L-A、CALSEPA、GNA、HHA、NPA、PA-IIL和PALA凝集素与生物素标记的HRP孵育后呈强荧光信号。已知这八种凝集素可以和甘露糖进行特异性结合,且后续分别以梯度增加HRP/甘露糖浓度进行实验,结果显示,结合的荧光信号都随浓度的增加而减弱,进一步表明HRP蛋白中含有甘露糖结构(与芯片上的凝集素进行特异性结合)。另外, AAL和RS-FUC两种凝集素(与岩藻糖特异性结合)也显示出与HRP的强相互作用,表明HRP发生岩藻糖基化。

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    不同类型样品凝集素芯片实测结果展示:


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    凝集素芯片应用案例

          
            上海儿童医学中心检验科杨蔺主任与华盈生物研发团队、上海交通大学陶生策教授课题组一起展开合作,以社区获得性肺炎为研究对象,通过凝集素芯片筛选血清糖基化谱,进一步结合质谱分析,找到潜在的肺炎血清诊断糖蛋白标志物HPR,有助于对儿童非细菌性肺炎与细菌性肺炎的鉴别诊断,相关研究成果发表在学术期刊《Proteomics - Clinical Applications》上。

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            该研究的论文作者有多名来自华盈生物研发团队,成功应用了华盈生物新建立的凝集素芯片-标志物研发方案,综合了蛋白芯片与质谱两种蛋白组学技术,为复杂疾病的临床标志物开发提供了新的研究思路,具有借鉴意义。也充分体现了华盈生物专业化技术服务的理念与研发实力。

    糖蛋白研究一体化方案:

     

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    1步:明确研究目的

            社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是儿童(尤其是婴幼儿)常见感染性疾病,也是5岁以下儿童死亡的首位病因。CAP常见病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。但不同病原体感染的婴幼儿早期症状无明显差别,传统的诊断方法存在不足,难以实现早期及时有效的诊断,因而临床上以经验性的广谱抗生素治疗为主,导致耐药以及部分患儿未及时针对性用药而延误病情的风险增加。因此临床上儿童肺炎尚缺乏有效的早期鉴别诊断标志物。

     
    2步:凝集素芯片助力血清糖基化谱筛选

           由于蛋白糖基化修饰的广泛性,无论病理条件下特定蛋白本身数量发生变化,还是糖基转移酶调控的修饰程度、类型发生变化,都可能导致样品中糖链“标签”的差异累积并呈现在整体水平上。而凝集素就是一种可以识别这类“标签”的工具蛋白,制备成蛋白芯片后大大提高了可以同时检测的“标签”通量(详见后文介绍),因此研究人员从蛋白糖基化筛选入手,应用凝集素芯片对正常儿童(NC)、支原体肺炎患儿(M)和细菌性肺炎患儿(B)的血清糖基化谱进行筛选。芯片结果显示,有4个凝集素(CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I)在不同组间有明显的差异结合信号,在总体水平上反映出不同血清样品中特定蛋白糖链的丰度差异。

     

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    图1  凝集素芯片筛选糖基化谱


    3步:
    凝集素芯片结果验证与延伸       
            其中,研究人员选取SNA-I进行lectin blot实验对筛选结果进行验证。和芯片检测一致,结果显示支原体肺炎组检测信号明显高于正常对照组和细菌性肺炎组。进一步发现,差异结合信号集中在42 kDa分子量附近,推测该分子量附近的蛋白可能有糖基化的上调或者蛋白表达量的上调。因此研究人员结合考马斯亮蓝染色结果进行分析,发现支原体肺炎组中42 kDa附近蛋白表达量有明显增加,并且和SNA-I的结合信号差异相关性很高(见图2),由此推测SNA-I结合信号的差异可能是由于42 kDa附近蛋白表达量增加导致的。

     

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    图2  lectin blot验证凝集素芯片结果

     
    4步:关键糖蛋白鉴定

           为了进一步明确是哪个蛋白的表达量发生了上调,研究人员以凝集素SNA-I为钓饵,进行了pull down实验。血清pull down产物(P-M3)经电泳分离后,对42 kDa分子量附近的蛋白条带进行了质谱鉴定。结果显示,高同源性蛋白HP和HPR的鉴定分值最高。随后通过western blot验证,发现HPR在支原体肺炎组(M组)中表达量明显上调,如图3。


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    图3  HPR可能是潜在的肺炎诊断标志物 


    5步:HPR标志物评判

           最后,研究人员应用western blot技术对更多例数的血清样品进行检测。结果显示:肺炎组的HPR水平要高于健康对照组(p<0.001),并且与细菌性肺炎组相比,HPR表达水平在非细菌性肺炎组(支原体肺炎组和病毒性肺炎组)更高(p<0.05),如图4。表明HPR可以作为潜在的儿童肺炎诊断指标,并且具有针对儿童细菌性肺炎与非细菌性肺炎的鉴别诊断的潜力。



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    图4  HPR标志物评判

    凝集素芯片文献

    1. Yang L, et al. Lectin Microarray Combined with Mass Spectrometry Identifies Haptoglobin-Related Protein (HPR) as a Potential Serologic Biomarker for Separating Nonbacterial Pneumonia from Bacterial Pneumonia in Childhood. Proteomics Clin Appl. 2018: e1800030. (上海儿童医学中心)
    2. Xin AJ, et al.
    Lectin binding of human sperm associates with DEFB126 mutation and serves as a potential biomarker for subfertility .Sci Rep-UK, 2016, 6(1): 20249.    (复旦大学生殖与发育研究院)
    3. Zhou S M, et al.
    Lectin RCA-I specifically binds to metastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res, 2015, 17(1): 36.  (上海交通大学)
    4. Tan Z, et al.
    Altered N-glycan expression profile in epithelial-to-mesenchymal transition of NMuMG cells revealed by an integrated strategy using mass spectrometry and glycogene and lectin microarray analysis. J Proteome Res, 2014, 13(6): 2783-2795.
    5. Bird-Lieberman E L, et al.
    Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus. Nat Med, 2012, 18(2): 315-321.
    6. Liu Y, et al.
    Identification and confirmation of biomarkers using an integrated platform for quantitative analysis of glycoproteins and their glycosylations. J Proteome Res, 2009, 9(2): 798-805.
    7. Tao S C, et al.
    Lectin microarrays identify cell-specific and functionally significant cell surface glycan markers. Glycobiology, 2008, 18(10): 761-769.